本发明专利技术公开了一种利用电化学方法制备纳米金和部分还原氧化石墨烯(p‑RGO)修饰的离子液体碳糊电极(CILE)，以此为平台构建了一种新的电化学DNA传感器，并将其成功应用于李斯特氏菌特征基因序列检测的方法。使用1‑己基吡啶六氟磷酸盐作为修饰剂制得基体电极CILE，在表面电沉积纳米金颗粒后通过控制电化学还原条件来制备p‑RGO，利用p‑RGO表面剩余的羧基，将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键共价键合法固定在电极表面构成ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE。与目标序列杂交后以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测杂交反应的进行，使用差分脉冲伏安法(DPV)对李斯特氏菌特征基因片段进行了检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型纳米复合材料修饰电极的电化学DNA传感器的制备及应用的方法
技术介绍
脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcid，DNA)是遗传信息的载体，具有传递和储存信息的功能。DNA存在于任何生物体、病毒、病原菌内，对于检测和诊断各种疾病有着重要的意义。由于DNA在医学诊断、环境监测、法医鉴定及食品卫生检验等方面具有重要的作用，因此如何快速准确的检测特定DNA序列具有重要的意义。电化学DNA传感器具有一系列的优点如检测快速、简单、灵敏，选择性高，操作简单，成本低等，在很多领域都有着广泛的应用前景。电化学DNA传感器是以电极作为换能器，在一定的条件下将单链DNA探针(probessDNA)通过一定的方法固定在工作电极表面，在适宜的条件(如温度、酸度、离子强度等)下，利用DNA链之间的碱基互补配对原理作用，与溶液中的互补ssDNA序列进行杂交形成双链DNA(dsDNA)，然后利用电化学方法来检测杂交前后的电化学信号的变化，达到对特定目标基因序列的定性检测，同时利用电化学信号与目标ssDNA的浓度之间存在的线性关系，可以实现对特定DNA序列的定量检测。电化学ssDNA传感器制备的主要步骤如下：(1)将探针ssDNA固定在电极表面；(2)与目标ssDNA序列进行杂交；(3)杂交反应的指示；(4)杂交信号的电化学检测。其中最为关键的是探针ssDNA的固定和杂交反应的电化学检测，探针ssDNA在电极表面的固定量和杂交反应的检测方法会影响电化学传感器的灵敏度。碳糊电极是利用导电性的石墨粉与憎水性的粘合剂混制成糊状物，然后填充在电极管中而制成的一类碳电极。它具有制备简单、价格便宜、选择性好、灵敏度高、电位适用范围宽及表面易于更新等优点，室温离子液体是指在室温及邻近温度下完全由阴阳离子组成的液体物质，它具有电化学窗口宽、导电率高、热稳定性和化学稳定性好等优点。离子液体可以作为粘合剂与石墨粉混合制备离子液体修饰碳糊电极(CILE)，离子液体的存在能够有效地改变电极的性能，既可以增加碳糊电极的稳定性，又可以增加导电效率。金纳米粒子由于具有生物相容性好、合成简单、导电性好及稳定性好等优点被广泛应用于电化学DNA传感器。修饰在电极表面的纳米金可以提高电极的有效面积、加快电化学催化过程中的电子传递以及提高电化学DNA传感器中探针ssDNA的固定量。石墨烯(graphene，GR)是以sp2杂化连接的单层二维纳米晶体，具有电化学窗口宽、稳定性高、比表面积大、电催化活性高、导电性优良等特点，已被广泛应用于电化学传感器领域，其大的比表面还能够负载更多的生物分子。石墨烯的制备方法主要有物理方法，机械剥离法，化学气相沉积法，热膨胀剥离法，电化学法，氧化还原法等，其中电化学还原氧化石墨烯法具有简单、高效、可控、低成本和无污染等优点。部分电化学还原氧化石墨烯(partialreductiongrapheneoxide，p-RGO)是通过控制电化学还原条件来还原氧化石墨烯(GO)表面的含氧基团，能够在一定程度上恢复GR的sp2杂化结构，增大GO的导电性，同时利用部分还原GO后表面剩余的含氧基团可作进一步修饰或应用。电化学沉积法是在含有要沉积的离子的溶液中，通过改变电化学条件，如改变电位或者沉积时间将要沉积离子均匀的沉积在阴极或者阳极模板上。电化学沉积法有以下优点如：通常情况，常温下就可以发生反应，反应温度低；通过监控转移的电荷数可以控制沉积薄膜的厚度；其组成和缺陷可以控制；可以在各种复杂形状的基底上沉积薄膜；可以进行非平衡相的沉积；驱动力可以进行精确的控制；耗费小等优点。电化学沉积法根据沉积电压和电流方式的不同，可以分为恒流电沉积法，恒压电沉积法，脉冲电沉积法，循环伏安法等；根据不同的复合手段又可以分为喷射电沉积，复合电沉积，模板法电沉积等。本实验首先制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE)，再对电极表面进行抛光处理，通过电化学沉积的方法在CILE表面先沉积金纳米颗粒，然后采用控制电化学还原法在其表面修饰p-RGO膜，利用p-RGO表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，制备出一种电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合材料修饰电极的电化学DNA传感器，进一步以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测其与目标序列的杂交反应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种DNA快速准确的电化学检测方法，具体方法是将金纳米颗粒通过电化学沉积的方法沉积在离子液体修饰碳糊电极表面，然后采用控制电化学还原法在其表面修饰p-RGO膜，利用电极表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，制备一种新型的电化学DNA传感器，以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测与目标序列的杂交反应。一种制备DNA传感器的方法，以离子液体修饰碳糊电极为基底层，利用恒电位沉积法在基底层上沉积出金纳米颗粒层，再用电化学还原法在金纳米颗粒层表面修饰p-RGO膜，利用电极表面剩余的羧基将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键固定在电极表面，其具体的制备步骤如下：(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)按2：1的质量比例混合放入玛瑙研钵中，研磨混合均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将上述修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，即可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)，使用前在洁净的抛光纸上打磨成镜面。(2)将氯金酸(HAuCl4)和硝酸钠(NaNO3)以一定比例混合后为电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗得到AuNPs/CILE，真空干燥备用。(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，取出用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p-RGO/AuNPs/CILE。(4)将p-RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS溶液中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合修饰电极的电化学DNA传感器的制备及应用的方法，包括：离子液体碳糊电极的制备方法，纳米复合材料修饰离子液体碳糊电极的制备方法，探针ssDNA的固定方法，纳米复合材料修饰碳糊电极测试李斯特氏菌特征基因片段的方法。其特征在于，包括以下步骤：(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐以2：1的质量比混合研磨均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)。(2)将氯金酸(HAuCl4)和硝酸钠(NaNO3)以一定比例混合制备电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥备用。(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，一定时间后取出电极用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p‑RGO/AuNPs/CILE。(4)将p‑RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针序列的电极(ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE)。(5)将含有目标序列的PBS直接滴涂在ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极记为dsDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE。(6)将杂交后的的电极浸入亚甲基蓝(MB)溶液中吸附一定时间中，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法(DPV)测定MB在Tris‑HCl缓冲溶液中的电化学行为，循环伏安在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl混合溶液中进行，扫速100mV/s；电化学交流阻抗在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3‑/4‑和0.1mol/L KCl混合溶液中进行，频率范围104～0.1Hz。...
【技术特征摘要】
1.一种基于电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合修饰电极的电化学DNA传感
器的制备及应用的方法，包括：离子液体碳糊电极的制备方法，纳米复合材料修饰离子液体
碳糊电极的制备方法，探针ssDNA的固定方法，纳米复合材料修饰碳糊电极测试李斯特氏菌
特征基因片段的方法。其特征在于，包括以下步骤：
(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐以2：1的质量比混合研磨均匀得到离
子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，可
得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)。
(2)将氯金酸(HAuCl4)和硝酸钠(NaNO3)以一定比例混合制备电解液，CILE为工作电极，
铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗
粒，用蒸馏水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥备用。
(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修
饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，一定时间后取出
电极用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p-RGO/AuNPs/CILE。
(4)将p-RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟
基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有
氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发
生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用
0.5％的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可
得到固定有探针序列的电极(ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE)。
(5)将含有目标序列的PBS直接滴涂在ssDNA/p-RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后
分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极记为
dsDNA/p-RGO/AuNPs/CILE。
(6)将杂交后的的电极浸入亚甲基蓝(MB)溶液中吸附一定时间中，取出后依次用0.5％
SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法(DPV)测定MB在Tris-HCl缓冲溶液中
的电化学行为，循环伏安在1.0mmol/LK3[Fe(CN)6]和0.5mol/LKCl混合溶液中进行，扫速
100mV/s；电化学交流阻抗在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/LKCl混合溶液中进行，频
率范围104～0.1Hz。
2.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：李光九，郑雯，刘俐华，王秀丽，陈玮，王文成，孙伟，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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