生物分子的同种型的体内代谢的同时测量制造技术

本发明专利技术包括同时测量生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。生物分子典型地产生在中枢神经系统中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术包括生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的同时测量的方法。
技术介绍
阿耳茨海默氏病(AD)是痴呆的最通常的原因，并且是日益增加的公共健康问题。 AD如同其他中枢神经系统(CNQ退行性疾病一样，特征在于生物分子产生、积聚和清除的紊乱。结果，需要测量生物分子在受试者中代谢的高效方法。特别地，需要同时测量在相同样品中的生物分子的不同异构体。这些方法将节省时间、金钱并需要来自给定受试者的更少的样品。专利技术概述本专利技术的一个方面包括同时测量在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。该方法包括将标记的部分施用至受试者。在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分典型地引入所述生物分子中。然后样品得自受试者，其中样品包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分。第一生物分子级分包含生物分子的两种或多种标记的同种型，并且第二生物分子级分包含生物分子的两种或多种未标记的同种型。各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量被检测，其中对于特定同种型标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。本专利技术另一方面包括一种确定治疗剂是否影响在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法。该方法包括将治疗剂施用至受试者并且将标记的部分施用至受试者。在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分典型地引入所述生物分子中。样品得自受试者，并且通常包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分。第一生物分子级分包含生物分子的两种或多种标记的同种型，并且第二生物分子级分包含生物分子的两种或多种未标记的同种型。生物样品中各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量被检测，其中对于特定同种型标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。比较各同种型的代谢和合适的对照值，使得对于特定同种型从所述对照值的改变指示所述治疗剂影响在所述受试者的所述中枢神经系统中所述特定同种型的代谢下面将更全面地描述本专利技术的其他方面和重述部分。附图简述附图说明图1示出通过纳升-LC串联MS检测在永生敲入鼠星形细胞表达人ApoE2或ApoE4 中的人ApoE同种型特定胰蛋白酶肽。将ApoE4培养基(0. 5ml)和ApoE2培养基(Iml)集合并在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。使样品变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联MS来分析。(A)用于各同种型特定肽的双电荷离子的提取离子色谱法。(B)具有标记的b和y离子的各肽的对应MS2谱。图2示出通过纳升-LC串联MS检测CSF中的人ApoE同种型特定胰蛋白酶肽。将来自年轻正常对照参加者的CSF(0. Iml)在4°C下用0. Iml的PHM-Liposorb 孵育30min。 使样品变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联 MS来分析。(A)和(B)衍生自具有ApoE3/4基因型的个体。提取离子色谱法示于(A)中用于各同种型特定肽的双电荷离子，并且对应的MS2谱显示于(B)。(C)和(D)衍生自具有 ApoE3/2基因型的个体。提取离子色谱法示于(C)中用于各同种型特定肽的双电荷离子，并且对应的MS2谱显示于(D)。图3示出ApoE3特定肽的检测。ApoE蛋白用WUE4抗体免疫沉淀，变性、还原和烷基化，并用胰蛋白酶消化以产生同种型特定肽，其通过纳升-LC串联MS来分析。(A)用于 ApoE3特定肽的提取离子色谱法。(B)各肽的对应MS2谱。图4展示从13C-标记的ApoE4和ApoE2星形细胞培养基中分离的各ApoE同种型特定胰蛋白酶肽的标准曲线。标记的和未标记的ApoE同种型特定肽通过串联MS检测，并且从标记与未标记的离子的比例来计算标记百分率。(A)ApoE3/2肽。(B)ApoE3/4肽。(C) ApoE2 肽。(D)ApoE4 肽。图5展示在永生敲入鼠星形细胞中产生人ApoE4。ApoE4表达星形细胞生长至融汇。在时间t = O将13C6-亮氨酸加入培养基，从而使13C6-亮氨酸总百分率至50%。在48 小时内收集培养基。ApoE用Iiposorb捕获，还原和烷基化。ApoE4特定肽通过纳升-LC MS/MS。SILT法用于测定13C6-亮氨酸引入ApoE(n = 3，误差线SEM)。ApoE4的级分合成率 (FSR)使用初始斜率与每小时8. 5%的坪示踪剂与被示踪物的比(TTR)来计算。图6展示ApoE同种型在人CNS中的代谢。ApoE2、ApoE3和ApoE4分离自从O至Mi 灌注13C6-亮氨酸Qmg/kg/h)的年轻正常对照参加者的CSF。(A)ApoE4 = LGADMEDVR(SEQ ID NO 3)，ApoE3 = LGADMEDVcGR(SEQ ID NO 1). (B)ApoE3 = LAVYQAGAR(SEQ ID NO 2)， ApoE2 = cLAVYQAGAR(SEQ ID NO :4)。TTR =示踪剂与被示踪物的比。图7示出可溶性APP-β在CHO培养基中的检测。(A).通过纳升-LC示出未标记和标记的可溶性APP-β的分离。两种肽在相同时间23. 洗脱。(B)示出未标记和标记的可溶性APP-β肽的成对图谱。图谱看起来类似，不同之处在于用箭头指示的离子质量的较小位移。指示的离子在标记的sAPP-β肽中更重3m/z，因为这些离子都是带双电荷的。 标记离子与未标记离子的信号强度的比较表示为离子的％标记与％未标记的比。多种离子的比被加合以提供整个sAPP-β肽的％标记未标记的精确比。图8示出可溶性APP-α在CHO培养基中的检测。(A).通过纳升-LC示出未标记和标记的可溶性APP-α的洗脱。两种肽在相同时间25. ISmin洗脱。(B)示出未标记和标记的可溶性ΑΡΡ-α肽的成对图谱。指示标记的离子在标记离子中更重2m/z，因为这些离子都是带三电荷的。标记离子与未标记离子的信号强度的比较表示为离子的％标记与％未标记的比。多种离子的比被加合以提供整个sAPP-β肽的％标记未标记的精确比。图9展示各sAPP- α和SAPP_ β肽的标准曲线。检测和定量的实际标记与未标记的比针对标记与未标记的理论百分率(基于CHO培养基的已知标记与未标记的亮氨酸)来绘制。(A)sAPP-a 肽。(Β)8ΑΡΡ_β 肽。图10示出表示在CSF中测量时在人受试者中在48小时内标记可溶性APP离子百分率与未标记可溶性APP离子百分率的比的变化的两个图。(A)表示可溶性ΑΡΡβ肽离子。 (B)表示可溶性APP α肽离子。可溶性APP α和可溶性APP β的产生和清除率可通过下列方式来确定计算加合的APP α或APP β肽离子的产生和清除率。图11示出从淀粉样四_4(|、淀粉样-β 29_42、淀粉样-β 29_38等的混合物中检测淀粉样_β29,肽。淀粉样用抗-淀粉样抗体免疫沉淀，并用胰蛋白酶消化。肽通过纳升-LC串联MS分析。㈧用于淀粉样-β 29-40肽的提取离子色谱法。⑶各肽的对应MS2谱。图12示出通过纳升本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种同时测量产生在受试者的中枢神经系统中产生的生物分子的两种或多种同种型的体内代谢的方法，该方法包括：ａ）将标记的部分施用至所述受试者，在所述受试者中产生所述生物分子时，所述标记的部分引入所述生物分子中；ｂ）从所述受试者获得生物样品，所述生物样品包含用所述部分标记的第一生物分子级分和不用所述部分标记的第二生物分子级分，所述第一生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种标记的同种型，并且所述第二生物分子级分包含所述生物分子的两种或多种未标记的同种型；以及ｃ）检测各标记的同种型的量和各未标记的同种型的量，其中对于特定同种型的标记的同种型与未标记的同种型的比例直接成比例于所述受试者中所述特定同种型的代谢。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·J·贝特曼，
申请(专利权)人：华盛顿大学，
类型：发明
国别省市：US