目前化学物质的毒理学检测主要是在体内完成的，其使用多种动物物种并且考虑人类临床、生物化学、病理学和形态学数据。在过去数年中，越来越清楚地发现，某些物质对于儿童的危害性特别高，因此，发育中的人类大脑的特定易攻击点是研究焦点。同时，推荐对具有已知的神经毒性或致畸（特别是神经致畸）风险的物质进行额外的胚胎毒性测试。此外，美国环保局（ＥＰＡ）要求对杀虫剂进行胚胎毒性测试。如果某物质用作药物，则要求进行另外的测试（Ｓ７Ａ ＳａｆｅｔｙＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｏｆ ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ，ＩＣＨ，２００１）。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于体外测试化学物质的发育毒性和胚胎毒性的蛋白生物标志物
技术介绍
目前化学物质的毒理学检测主要是在体内完成的，其使用多种动物物种并且另外 考虑人类临床、生物化学、病理学和形态学数据。在过去数年中，越来越清楚地发现，某些 物质对于儿童的危害性特别高，因此，发育中的人类脑的特定易攻击点是研究焦点。同时， 推荐对具有已知的神经毒性或致畸(特别是神经致畸)风险的物质进行额外的胚胎毒性测 试。此外，美国环境保护局(EPA)要求对杀虫剂进行胚胎毒性测试。如果某物质用作药物， 贝Ij要求进行另夕卜的测试(S7ASafety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals, Guidelinesof the International Conference on Harmonization, ICH, 2001)。化学物质的发育神经毒性研究受到US EPA的指南(测试指南870. 63000)和OE⑶ 的指南草案(0ECD指南426)的指引。根据这些指南进行的体内研究包括实验动物(通常 是大鼠)的脑的形态学研究、成套的行为测试、年幼动物(直至成年期)的发育研究、神经 胶质增生和细胞毒性的生物标志物的测定，以及另外的生物标志物的研究。这些毒性测试 需要大量的实验动物对于每种物质，在3-4个月的时间内将消耗大约140只母代动物及其 1000只后代。由于技术和物流上的需要，这些体内测试的人力和成本耗费非常高。然而，关 键一点是，在相应的指南和动物中，没有清楚的定义可信赖的和明确的末端点。目前的测试 是否真能预测人类中枢神经系统的发育和相关毒性，是不确定的。在美国，这种情况已经引 起动物权利和保护组织例如PETA的请愿，请求废除指南OPPTS 870. 6300。目前，在欧洲市场上有大约100，000种化学物质。但是，这些物质中仅有一少部分 的可靠的毒理学数据是可以获得的。尤其是那些在1981年以前上市的化学物质，缺少安全 性数据。因此，不能全面评估对雇员、消费者和环境的危险。为了改善这种不令人满意的状 况，欧盟委员会(European Commission)提出了所谓的REACH概念，即化学物质的注册、评 价禾口认证(Registration, Evaluation andAuthorization of Chemicals)。REACH 的目标 是系统地评价生产、使用或进口的数量在每年1顿以上的化学物质的危险。化学物质的安 全性证明的负担将落在生产者和制作者身上。关于欧洲的REACH立法和美国及日本的相似 发展(Schrattenholz和Klemm，2006和2007)，似乎测试化学物质的发育神经毒性的需要将 导致在可预见的将来测试动物消耗的大规模增长。在这个背景下，毒性相关筛选的高度预测性的、省时的体外测试法的开发变得日 益重要。细胞培养模型将作为高度争议性的、有问题的、有时令人讨厌的动物实验的替代 品。目标是取代目前评估神经毒性、尤其是神经发育毒性的法令所需要的动物测试，这些动 物测试成本非常高且非常耗时。体外模型已经在药理学领域应用了数年。很多目前的体外检验涉及分化模型，其 使用胚胎干细胞。胚胎干细胞测试(EST)显示出很有前景的结果，该测试能够区分强烈致 畸的、中等的或无胚胎毒性的化合物(Spielmarm等人，1997)。EST利用小鼠胚胎干细胞在 培养物中分化的潜力，从而在体外测试胚胎毒性。该模型有局限性，部分原因是，仅仅对那 些破坏心脏分化的化合物定义了毒理学末端点。因此，本领域需要一种改进的体外方法，用于可靠地确定化学物质和药物的毒性。 特别地，本领域需要提供新型的、快速的和智能的体外测试策略以测定发育毒性。本专利技术的目标是提供用于体外筛选化学物质的毒性、尤其是发育毒性的方法和试 剂。
技术实现思路
本专利技术人发现，特异性蛋白生物标志物是化学和药物化合物的发育毒性的诊断。 物质对这些生物标志物的影响是该物质的发育毒性的预测。所述影响可以这样测定将其 中产生至少一种蛋白生物标志物的细胞样品与物质接触，并测定由于暴露于该物质造成的 该细胞样品中所述蛋白生物标志物的变化。在一个方面，本专利技术提供了用于测定物质的发育毒性的体外方法，其包括以下步 骤⑴将细胞样品暴露于该物质；和(ii)测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化。本专利技术的“蛋白生物标志物”选自热休克蛋白β -1 (HspBl)、Ras-GTP酶-活化 蛋白SH3-结构域结合蛋白(G!3BP)、Ran结合蛋白5 (RanBP5)、钙网蛋白(Calr)、二氢嘧啶 酶-样2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1 (STIPl)、Uhf2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型 CRA_b (Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1 (NMRLl)，及其翻译后同种型。本专利技术的生物标志物是熟知的蛋白。这些蛋白的通常命名总结于表1。表 权利要求1.用于测定物质的发育毒性的体外方法，其包括以下步骤 (i)将细胞样品暴露于该物质；和( )测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化， 其中所述蛋白生物标志物选自热休克蛋白β-1 (HspBl)、Ras-GTP酶-活化蛋白 SH3-结构域结合蛋白(G3BP)、Ran结合蛋白5(RanBP5)、钙网蛋白(Calr)、二氢嘧啶酶-样 2(DRP2)、应激诱导的磷蛋白1 (STIPl)、Uhf2蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_ b (Cab39)、含有NmrA-样家族结构域的1 (NMRLl)、及其翻译后同种型。2.权利要求1的方法，其中所述细胞样品选自器官样品、组织、体液、细胞和细胞裂解物。3.权利要求1的方法，其中所述细胞样品包括脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞例 如人类细胞。4.权利要求1的方法，其中所述细胞样品包括干细胞，特别是全能的、多能的、多潜能 的和/或寡能的干细胞。5.权利要求1的方法，其用于测定胚胎毒性，其中所述细胞样品包括胚胎干细胞。6.权利要求1的方法，其中步骤(ii)包括定性或定量测定一种或多种生物标志物。7.权利要求1的方法，其中持续测定细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化。8.权利要求1的方法，其中一种或多种生物标志物的测定包括免疫学测定、活性测定 和/或分子测定。9.权利要求1的方法，其中一种或多种生物标志物的测定包括荧光检测。10.权利要求1的方法，还包括测定至少一种另外的蛋白生物标志物，所述另外的蛋白 生物标志物选自热休克蛋白8 (HSP8)、应激诱导的磷蛋白1 (P-同种型2) ,Fascin同源物1， 肌动蛋白集束蛋白(Fscnl)、核不均一核糖核蛋白A/B同种型2，及其翻译后同种型。11.一种或多种蛋白用作测定物质的发育毒性的生物标志物的用途，所述蛋白选自热 休克蛋白β-I(HspBl)、Ras-GTP酶-活化蛋白SH3-结构域结合蛋白(G!3BP)、Ran结合蛋白 5 (RanBP5)、钙网蛋白(Calr)，二氢嘧啶酶-样2 (DRP2)、应激诱导的磷蛋白1 (STIPl) ,U2af2 蛋白(U2AF)、钙结合蛋白39，同种型CRA_b(Cab39)、含有NmrA-样本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于测定物质的发育毒性的体外方法，其包括以下步骤：（ｉ）将细胞样品暴露于该物质；和（ｉｉ）测定由于暴露于该物质造成的该细胞样品中一种或多种蛋白生物标志物的变化，其中所述蛋白生物标志物选自热休克蛋白β－１（ＨｓｐＢ１）、Ｒａｓ－ＧＴＰ酶－活化蛋白ＳＨ３－结构域结合蛋白（Ｇ３ＢＰ）、Ｒａｎ结合蛋白５（ＲａｎＢＰ５）、钙网蛋白（Ｃａｌｒ）、二氢嘧啶酶－样２（ＤＲＰ２）、应激诱导的磷蛋白１（ＳＴＩＰ１）、Ｕ２ａｆ２蛋白（Ｕ２ＡＦ）、钙结合蛋白３９，同种型ＣＲＡ＿ｂ（Ｃａｂ３９）、含有ＮｍｒＡ－样家族结构域的１（ＮＭＲＬ１）、及其翻译后同种型。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·施拉藤霍尔茨，
申请(专利权)人：普罗迪奥塞斯股份公司，
类型：发明
国别省市：DE
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