一种脂笼蛋白的高效表达、复性、纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种脂笼蛋白的高效表达、复性、纯化方法。所述方法通过在特定的阶段调节特定的pH值以及选择合适的变性剂和复性剂，有效地提高了可溶性蛋白的得率和纯度，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
脂笼蛋白(lipocalin)家族是由小的分泌型蛋白组成，其成员遍布脊椎动物、无脊椎动物、植物和细菌中，大小一般是120-180个氨基酸。在一级序列上，脂笼蛋白都含有短的保守域，它们的三级结构中通常含6-或者8-链的β折叠形成一个桶状结构ο过去，这个家族的蛋白主要被归为一类转运蛋白，但现在发现它们还具有一些其他的重要功能，主要有配体转运，视觉，嗅觉，限制性内切酶活性，细胞稳态调节，免疫反应等等。脂笼蛋白能够在大肠杆菌中高水平表达，但是以包涵体的形式存在，为了研究 rLcn 8的结构与功能，需要分离包涵体进行变性与复性、纯化后进行晶体生长以及荧光光谱分析。然而，如何对包涵体进行变性和复性，并且在复性后获得生物活性良好的蛋白，对于本领域人员而言较难。因此，需要对此进行深入研究，从而建立一种有效的获得生物活性良好的可溶性蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供。在本专利技术的第一方面，提供一种制备可溶性脂笼蛋白的方法，所述方法包括(1)将脂笼蛋白的包涵体进行变性，分离含有经变性的脂笼蛋白的上清；(2)调节所获得的上清的PH值至5-6，用聚合度为200-1000的PEG和C2-C8 (如 C3、C4、C5、C6、C7)的多羟基醇进行复性，获得可溶性脂笼蛋白。在另一优选例中，采用盐酸调节PH值至5-6。在一个优选例中，所述的包涵体如下表达(a)将含有脂笼蛋白编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达脂笼蛋白的包涵体。在另一优选例中，IPTG的浓度是1 士0. 2mmol/L。在另一优选例中，所述的方法还包括破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有脂笼蛋白的包涵体。在另一优选例中，采用Tirs-HCl、NaCl和甘油破碎。在另一优选例中，采用50士 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、100士20mmol/LNaCl、 5士 (ν/ν)甘油破碎。在另一优选例中，所述的方法，还包括对获得的沉淀进行洗涤，去除部分杂质。在另一优选例中，，所述的洗涤包括步骤用尿素悬浮沉淀，勻浆，超声波粉碎后离心弃上清。在另一优选例中，所述步骤重复2-3次。在另一优选例中，所述的尿素浓度为1 士 0.2mol/L。在另一优选例中，采用5士 lmol/L盐酸胍溶液对脂笼蛋白的包涵体进行变性。在另一优选例中，所述的盐酸胍溶液中还含有NaH2PCV在另一优选例中，用盐酸胍溶液处理脂笼蛋白的包涵体，离心去除沉淀，获得含有经变性的脂笼蛋白的上清。在另一优选例中，所述的脂笼蛋白的N端含有Hi s-TAG (较佳地为6 X Hi s)，且步骤 (1)和步骤(2)之间还包括步骤调节步骤(1)获得的上清的PH值至8.0 士 0.5，用镍(Ni) 柱纯化，获得经纯化的上清。在另一优选例中，用Na2HPO4调节PH值至8. 0。在另一优选例中，采用透析的方法进行复性，以含有PEG和多羟基醇的水溶液作为透析液；透析后离心获取上清。在另一优选例中，还包括将上清进行浓缩。在另一优选例中，所述的透析或浓缩在4°C进行。在另一优选例中，所述的PEG浓度按照体积比为10士2% ；或所述的多羟基醇的浓度按照体积比为10 士 2%。在另一优选例中，所述的PEG的聚合度是300-600。更佳地，所述的PEG的聚合度是 350-600。在另一优选例中，所述的多羟基醇是甘油。在另一优选例中，所述的脂笼蛋白是脂笼蛋白8型(LcnS)。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、rLcn8的表达纯化电泳结果。1 未诱导的pET/rLcn 8 ；2 诱导的pET/rLcn 8 ；3 :PET/rLcn8诱导超声波裂解后的上清；4 :PET/rLcn8诱导超声波裂解后的沉淀；5 lmol/L尿素洗涤3次后的包涵体rLcn 8 ；6 :50mmol/L咪唑洗脱；7 :500mmol/L咪唑洗脱。M 标准蛋白分子量marker。图2、变性的rLcn 8Ν 柱纯化电泳图。1 盐酸胍溶解的rLcn 8 ;2 过Ni柱穿透峰；3 用50mM咪唑洗脱峰；4 用500mM咪唑洗脱峰。图3、rLCn 8蛋白的荧光波谱扫描。图4、|对⑷]做线性回归。F图5、不同醇的复性效果的电泳测试。其中，1、2、3、4对应1#、2#、3#、4#条件，P是指复性后的样品经过离心后的沉淀，S则是指复性后的样品经过离心后的上清。具体实施例方式本专利技术人经过深入的研究，找到一种从包涵体形式的脂笼蛋白制备可溶性蛋白的新方法，所述方法通过在特定的阶段调节特定的PH值，特别是在复性的阶段将PH值调节到弱酸性从而增加蛋白的溶解程度，有效地提高了可溶性蛋白的得率和纯度，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。本专利技术的制备可溶性脂笼蛋白的方法，包括以下步骤(1)将脂笼蛋白的包涵体进行变性，分离含有经变性的脂笼蛋白的上清；(2)调节所获得的上清的PH值至5-6，用聚合度为200-1000的PEG和C2-C8的多羟基醇进行复性，获得可溶性脂笼蛋白。蛋白的表达本专利技术人尝试了采用多种表达系统(如酵母系统，大肠杆菌系统)来表达脂笼蛋白，结果发现大肠杆菌系统较适于表达脂笼蛋白，获得包涵体形式的蛋白。研究表明包涵体形成的主要原因是蛋白质表达速度过快，以致蛋白质没有足够的时间进行正确的折叠；另外由于大肠杆菌的胞质环境是一个还原性的环境，导致蛋白质中的二硫键无法正确配对，这也是导致包涵体形成的一个重要原因。在研究之初，本专利技术人曾试图通过低温、 低浓度IPTG诱导大肠杆菌rLcn 8的可溶表达，但是表达结果显示这些方法对提高rLcn 8(重组Lcn 8)的可溶表达并无明显效果。也即，只能采取包涵体表达，后续进行变复性获得可溶性蛋白这一途径。因此，作为本专利技术的优选方式，所述的包涵体如下表达(a)将含有脂笼蛋白编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达脂笼蛋白的包涵体。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有编码目的蛋白的DNA序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。培养基因工程菌并使之表达目的蛋白的方法和条件是本领域人员已知的，例如可采用IPTG或者高温诱导表达。较佳地，采用IPTG诱导表达；更佳地，IPTG的浓度是1 士0.2mmol/L0在基因工程菌表达了包涵体蛋白后，通常需要进行破菌(即破碎大肠杆菌细胞)，从而释放出包涵体蛋白。破菌的方法没有特别的限制，例如超声破菌或高压均浆破菌。作为本专利技术的优选方式，采用TirS-HCl、NaCl和甘油破碎大肠杆菌细胞；更佳地， 采用 50士 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、100士20mmol/L NaCl、5士 (ν/ν)甘油破碎。破碎细胞后，分离获取沉淀，其中含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种制备可溶性脂笼蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：（１）将脂笼蛋白的包涵体进行变性，分离含有经变性的脂笼蛋白的上清；（２）调节所获得的上清的ＰＨ值至５－６，用聚合度为２００－１０００的ＰＥＧ和Ｃ２－Ｃ８的多羟基醇进行复性，获得可溶性脂笼蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林胜祥，陈泽庸，邹永水，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：31