一种负载生物活性因子的仿生涂层制备方法技术

本发明专利技术提供一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过在碳化二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺催化体系下，将含双硫键的RGD多肽链段接枝到聚电解质上，再配制成RGD接枝的聚阴离子电解质溶液和RGD接枝的负载生物活性因子聚阳离子电解质溶液，将聚阴离子电解质溶液和负载生物活性因子的聚阳离子电解质溶液组合，利用静电自组装技术，在种植体表面构建负载有生物活性因子的有机复合涂层。该复合涂层解决了长期以来限制生物活性因子在种植体周围应用的瓶颈问题，可促进种植体周围成骨的早期发生，早日实现骨整合，有利于种植体的长期稳定性。该方法操作简单，制备条件温和，方便可控，能连续生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医用材料制造
，涉及，尤其涉及一种具有生物活性因子缓释功能的仿生涂层制备方法，是牙科钛种植体表面生物活化改性的处理方法。通过该方法在种植体表面构建的仿生涂层模拟了天然胞外基质的组织形式，既有生物大分子子构成其主体结构又负载了能调节细胞行为的生物活性因子，通过该涂层实现的一种或多种生物活性因子的缓释效应能促进种植体与骨组织之间的快速骨整合，也有利于种植体的长期稳定性。
技术介绍
由Branemark教授提出的骨整合(Osteointegration )理论是口腔种植领域的核心理论。种植体与周围骨组织实现骨性结合是是评价种植成功与否的重要标准之一。为了达到这一标准，许多学者在种植材料及表面处理方面做了大量的工作。这些种植体表面处理方法的实施，其基本原理都是通过干预种植体周围组织修复愈合的过程，来加快种植体周围骨组织的形成速度，从而缩短种植义齿的治疗周期。种植体植入体内到实现与周围骨组织的骨性结合一般会经历成骨源性细胞的募集、粘附、增殖和分化，最后是钙盐的沉积和骨质矿化成熟的过程。种植体与血液接触后在其表面吸附形成的蛋白层对成骨源性细胞对种植体表面的识别与粘附有重要作用，而成骨源性细胞的募集，增殖和分化以及随后的钙盐沉积过程受到种植体周围局部成骨微环境的影响，包括局部生物活性因子的种类和浓度等。基于对种植体周围组织修复愈合过程了解的加深，以及对于细胞在基底表面的粘附机制和生物活性分子在调节细胞分化和组织重建方面作用的最新认识，将有机分子引入种植体表面成为近年来种植体表面改性方法研究中的热点问题。一方面，这些有机分子模拟了胞外基质的主要成分，为成骨源性细胞在种植体表面生长提供了有利的环境；另一方面，选择性的使用一些已知功能的生物活性因子，特别是具有显著促进细胞和骨组织反应功能的生长因子，能更加有效的调节和控制种植体周围的组织愈合过程。将有机分子引入种植体表面的方法也被称之为表面生化改性。种植体表面生化改性中涉及的有机分子包括几类一类是大分子量的成分，主要是胞外基质成分如胶原和硫酸软骨素等；一类是小分子量的促粘附多肽如含RGD (Arg-Gly-Asp,精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的多肽序列；还有一类是具有很强生物活性的生长因子类成分如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs),成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)，转化生长因子(transform growth factors, TGFs)等。现有的体内体外研究证实，这些有机分子的应用，对种植体表面的细胞和组织反应都有积极的效应。特别是生长因子类成分的单独或者联合其他有机分子的应用，能为种植体表面的细胞生长提供额外的线索，从而增加种植体周围的骨组织再生。现在种植体表面生化改性中存在的瓶颈问题是缺乏有效的手段将这些有机分子引入到种植体表面，尤其是对于具有高生物活性的生长因子类成分。理想的将有机分子引入种植体表面的技术手段应该具有这样的特征在种植体表面构建的有机分子涂层不仅保留其生物学活性，而且其降解或者释放的动力学过程与组织愈合的过程相匹配。 显然现有的技术手段如物理吸附和化学偶联的方式满足不了这样的要求。前者引入的涂层分布不均、效率低下、稳定性差、重复性差以及结合力小容易在种植体植入过程中被擦掉。 而后者容易引起生物活性因子的构象而影响其生物学活性。在酶解，水解以及还原性物质的作用下，上述聚电解质复合涂层在生理条件下的降解还是相对比较快的(存在时间约4-7天)。调节其降解速率并实现负载在涂层内的生物活性因子的缓释作用依赖于对该聚电解质复合涂层稳定性的进一步调控。研究表明，二硫键(-S-S-)在维持生物大分子特别是蛋白质的天然构象和稳定性中发挥着重要作用，且二硫键可在还原条件下被打开形成巯基(-SH)，而巯基很容易被氧化成二硫键。这两者发生相互转化的反应条件相对温和，对生物大分子的活性损伤较小。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过以下步骤实现(I)RGD接枝的聚电解质的制备首先是合成含双硫键的RGD多肽链段甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-S-S-半胱氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸 (GRGDSPC(S-S)CPSDGRG),由 SciLight Biotechnology, LLC 公司合成，然后在碳化二亚胺 :N_ 羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimide, NHS)催化体系存在的条件下，该多肽链段接枝到聚电解质上， 将所得到的产物透析纯化后，加入木苏糖或者谷胱甘肽与之进行反应，将多肽链段间的双硫键打开得到甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸-SH (GRGDSPC-SH)接枝的聚电解质，从而实现聚电解质的改性。聚电解质为聚阳离子聚电解质和聚阴离子聚电解质。本专利技术所述的RGD是一种含精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸的线性七肽结构，其肽链结构为甘氨酸_精氨酸_甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-SH(GRGDSPC-SH)。本专利技术所述RGD接枝的聚电解质均指的是被修饰了甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸_丝氨酸_脯氨酸_半胱氨酸序列，并具有自由活泼巯基的聚电解质。所述的聚阴电解质选用透明质酸、碱溶明胶、聚谷氨酸、聚天冬氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阴离子电解质。聚阴离子电解质的分子量从 100-5000000D。所述聚阳电解质选用I型胶原、壳聚糖、酸溶明胶、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸中的一种或者几种，得到的产物是RGD接枝的聚阳离子电解质。聚阳离子电解质的分子量从 100-2000000D。所述聚电解质的浓度为0. l-50mg/ml，其中最佳浓度为5mg/ml ；所述的多肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比例为1 :10000-1 :1，其中最佳浓度比率为1 :20-50 ； 所述的碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺(EDCNHS)的用量为1 :1_20 :1，其中最佳浓度比例为10-5 1 ；EDC的用量与多肽链段的用量的摩尔比例为1 :1_10 :1，其中最佳浓度比例为2-5 1 ；所用的木苏糖或者谷胱甘肽的浓度与EDC:NHS体系中双硫键的摩尔比例为1 1-50 :1，其中最佳摩尔浓度比例为5 :1。(2)聚电解质溶液的配制添加有生物活性因子(BMP-2或bFGF)的聚阳离子电解质溶液的配制将经步骤(1)获得的RGD接枝的聚阳离子电解质或未改性的聚阳离子电解质配制成溶液，并在其中添加生物活性因子BMP-2或bFGF，配制成具有一定生物活性因子浓度的聚阳离子电解质溶液。生物活性因子(bmp-2或bFGF)只添加在聚阳离子电解质溶液里，因为两者在PH值在4. 0左右都带正电荷。聚阴离子电解质溶液的配制将经步骤(1)获得的RGD接枝的聚阴离子聚电解质或未改性的聚阴离子电解质配制成溶液。步骤(2)中各种聚电解质溶液的浓度范围均为0. lmg/ml-10mg/ml，其中最佳浓度范围为0. 5-lmg/ml，其中聚电解质溶液中Na本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种负载生物活性因子的仿生涂层的制备方法，通过以下步骤实现：（１）ＲＧＤ接枝的聚电解质的制备：将含双硫键的ＲＧＤ多肽链段ＧＲＧＤＳＰＣ（Ｓ－Ｓ）ＣＰＳＤＧＲＧ在碳化二亚胺：Ｎ－羟基琥珀酰亚胺催化体系存在的条件下，接枝到聚电解质上，将所得到的产物透析纯化后，加入木苏糖或者谷胱甘肽与之反应，得到甘氨酸－精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－脯氨酸－半胱氨酸－ＳＨ接枝的聚电解质，聚电解质分别为聚阳离子聚电解质和聚阴离子聚电解质；所述的ＲＧＤ是含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸的线性七肽结构，其肽链结构为甘氨酸－精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸－脯氨酸－半胱氨酸－ＳＨ；所述聚电解质的浓度为０．１－５０ｍｇ／ｍｌ，多肽链段的量与聚电解质中羧基含量的摩尔比为１：１００００－１：１，碳化二亚胺：　Ｎ－羟基琥珀酰亚胺的用量为１：１－２０：１，　碳化二亚胺的用量与多肽链段的用量的摩尔比为１：１－１０：１，木苏糖或者谷胱甘肽的浓度与催化体系中双硫键的摩尔比为１：１－５０：１；（２）聚电解质溶液的配制：聚阳离子电解质溶液配置：将步骤（１）获得的ＲＧＤ接枝的聚阳离子聚电解质或未改性的聚电解质阳离子配制成溶液，并在其中添加生物活性因子ＢＭＰ－２或ｂＦＧＦ；聚阴离子电解质溶液的配制：将步骤（１）获得的ＲＧＤ接枝的聚阴离子聚电解质或未改性的聚阴离子电解质配制成溶液；其中各种聚电解质溶液的浓度范围为０．１ｍｇ／ｍｌ－１０ｍｇ／ｍｌ，聚电解质溶液中ＮａＣｌ浓度为０．１－０．２ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值为４．０，ＢＭＰ－２的浓度为０．５－１０００μｇ／ｍｌ，ｂＦＧＦ浓度为２０－１０００μｇ／ｍｌ；（３）仿生涂层的制备：将步骤（２）配置的溶液作如下组合：（ａ）添加生物活性因子ＢＭＰ－２或ｂＦＧＦ的ＲＧＤ接枝的聚阳离子聚电解质溶液和未改性的聚阴离子电解质溶液；（ｂ）ＲＧＤ接枝的聚阴离子聚电解质溶液和添加生物活性因子ＢＭＰ－２或ｂＦＧＦ的未改性的聚阳离子电解质溶液；（ｃ）添加生物活性因子ＢＭＰ－２或ｂＦＧＦ的，在双氧水中浸泡时间为５－６０分钟。一次沉积循环，根据需要重复以上循环操作，最后得到需要的聚电解质复合层，然后，在浓度为０．５－１０　ｍＭ的氯胺Ｔ溶液或者浓度为１－５０　ｍＭ的双氧水溶液中浸泡，取出，充分水洗，得到负载生物活性因子的仿生涂层；在氯胺Ｔ中的浸泡时间为５－１８０秒ＲＧＤ接枝的聚阳离子聚电解质溶液和ＲＧＤ接枝的聚阴离子聚电解质溶液；用（ａ）－（ｃ）任一组溶液，首先在钛基种植体表面沉积聚阳离子电解质和生物活性因子，沉积一定时间后，充分水洗，然后沉积聚阴离子电解质层，沉积一定时间后，充分水洗，以上操作记为...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓东，黄颖，李晓军，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86