本发明专利技术涉及重组人蛋白vasostatin的中试规模制备方法，所述方法是将编码基因通过原核表达载体导入大肠杆菌中表达，获得重组人VAS蛋白，在构建重组Vasostatin/E.coli?BL21工程菌基础上，进行发酵罐发酵，产物复性、纯化；体外实验研究表明，中试规模制备的重组人蛋白vasostatin具有抗肿瘤、抑制内皮细胞增殖和抑制内皮细胞迁移等作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组人蛋白的中试规模制备方法。
技术介绍
重组人vasostatin 蛋白(Vasostatin，VAS)，最早由 Pike 等人于 1998 年从在 EB 病毒的悬浮液中纯化出，这种纯化的重组N末端的钙网蛋白(1-180个氨基酸)专一性地抑制了内皮细胞的增殖，且能抑制体内血管的生成。VAS是一种内源性蛋白，由180个氨基酸组成，前17个氨基酸为信号肽，含有8个反相平行的β链，可以结合Si2+，能够与一些蛋白相互作用。Pike等人还对vasostatin活性区进行了研究，结果发现，主要的活性区在N端第120-180个氨基酸，此段蛋白序列具有同样的抗血管生成活性。研究结果提示，VAS抑制血管生成的主要原因可能具有以下几点(1)与层粘连蛋白的α链和Υ链相结合，进而抑制了内皮细胞结合到层粘连蛋白上；(2)诱导细胞凋亡；促使细胞产生自由基和释放NO。最近有研究表明，VAS具有抑制炎症的作用，这是因为炎症会导致血管通透性增加，血浆外渗，白细胞增多，形成新生血管。本课题组利用重组腺相关病毒作为VAS表达载体(rAAV-VAS)，体外转染小鼠胰内皮细胞MSl和结肠癌细胞HCT-116，然后测定对细胞生长的影响，并通过小鼠皮下移植瘤模型，验证vasostatin的表达对肿瘤生长、新生血管密度以及对细胞增殖的作用。结果显示， 使用rAAV-VAS病毒载体进行治疗后，HCT-116移植瘤新生血管的形成受到抑制，在小鼠体内的生长速度明显减缓。然而，重组蛋白治疗药物当前的现状是，使用rAAV病毒进行临床治疗目前还存在诸多疑虑；融合蛋白必须将两种蛋白同时使用，不利于单独使用及个性化治疗；藻酸盐包裹目的基因后形成的微囊化物质，也存在基因导入后呈长期表达，不易于表达调控的问题。 (引用文献)本课题组已成功克隆了人VAS基因，并采用pET22b载体和E. coli BL21表达系统， 中试规模制备VAS，得到了含量占菌体总蛋白50%以上的重组vasostatin蛋白。与已报道的其他包涵体蛋白的复性方法不同的是，本项研究利用层析柱上脱盐复性，简单方便地纯化了重组VAS蛋白。进一步通过细胞实验表明，所述重组VAS蛋白可用于抑制内皮细胞的增长，抑制细胞迁移，具有抗血管生成的活性。为了得到可溶性的VAS蛋白，本课题组还进行了真核表达研究，根据毕赤酵母偏好密码子人工合成了 VAS的N端120-180个氨基酸(VASS)的DNA序列，利用pPIC9载体和毕赤酵母表达系统以及NBS 7. 5L发酵罐进行中试表达制备。本专利技术的目的是提供一种重组人VAS蛋白和VASS蛋白中试规模制备的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种基因工程中试规模制备重组人VAS蛋白的方法，所述方法是将编码基因通过原核表达载体导入大肠杆菌中表达，获得重组人VAS蛋白。其中，大肠杆菌为E. coliBL21 ；当编码基因导入大肠杆菌细胞系时，原核表达载体为pET22b。本专利技术所述中试规模制备重组人VAS蛋白的主要步骤是1)获取Vasostatin基因利用RT-PCR，从人的正常肝细胞中克隆Vasostatin基因(参照《分子克隆实验指南》北京科学出版社，2002. 8)；2)构建重组Vasostatin/E. coli BL21工程菌采用基因工程技术构建 Vasostatin重组载体pET22b_Vasostatin/E. coli BL21工程菌(参照《细胞工程与分子生物学技术》化学工业出版社2008年4月)；3)中试规模制备重组Vasostatin蛋白在构建重组Vasostatin/E. coli. BL21工程菌基础上，进行7. 5L发酵罐发酵，然后利用细胞反复冻融，用尿素溶解包涵体后，依次经 G-25复性、DEAE结合、G-25脱盐，获得一定浓度和纯度的蛋白；4)Vasostatin蛋白体外抗肿瘤实验利用重组纯化后的Vasostatin蛋白处理肝癌细胞、肺癌细胞及Hela细胞；5) Vasostatin体外抑制内皮细胞增殖实验利用MTT实验检测；6) Vasostatin体外抑制内皮细胞迁移实验利用transwell研究Vasostatin对体外内皮细胞迁移的作用；7)数据统计分析实验数据采用平均数士标准误差。student’ s t-test被应用于检验是否显著差别，P值< 0. 05则视为统计学上显著差别。本专利技术根据Genebank 中公开的 calreticulin 基因序列(GENBANK Accession Number为AY047586)，采用PCR技术，从肝组织cDNA文库中获取成熟VAS蛋白全长基因序列，将该基因插入到E. coli BL21的表达载体pET22b中进行表达，成功地表达出重组人VAS 蛋白，重组蛋白占菌体总蛋白的50%以上。经过细胞学实验，重组蛋白具有抗内皮细胞增殖的活性，并可以抑制内皮细胞迁移。本专利技术还提供了一种制备重组人VASS蛋白的方法。所述方法，是按照偏好密码子合成基因后，将所述基因通过真核表达载体导入毕赤酵母中表达，获得重组人VASS蛋白。 所述方法中，使用的宿主菌为毕赤酵母GS115。所述编码基因导入毕赤酵母中时，真核表达载体为PPIC9。具体路线如图8所示。将阳性克隆在BMG培养基中活化，然后培养至对数期接入NBS发酵罐中，pH6. 0， ^°C，用一定流速的甲醇连续诱导96h，按照发酵情况调整转速(发酵罐中的基础盐培养基 (Γ1)为13. 3ml 85%磷酸，0. 93g CaSO4,18. 2g K2SO4,14. 9g MgSO4 · 7Η20，4· 13g Κ0Η, IOg 甘油)。所述方法中，合成基因片段为CTCGAGAAGAGAGACATGCATGGTGATTCTGAATACAACATCATGTTTGGTCCGGACATTTGTGGTCCGGGTACCAAGAAGGTTCATGTTATCTTCAACTACAAGGGTAAGAACGTTCTGATCAACAAGGACATTCGTTGTAAGGATGATGAGTTTACCCATCTGTACACTCTGATTGTTCGTCCGGATAACTAAGAATTC附图说明图I-Vasostatin原核表达载体构建其中M-DL2000； 1-PCR 产物；2_pET_2^(+)空质粒；3_pET_2^ (+)-VAS 重组质粒。图2-重组vasostatin的诱导表达及纯化其中M-低分子量marker ； 1_空转BL21 ；2_总蛋白；3_包涵体洗涤；4-G-25脱盐峰；5-穿透峰；6-0. 15M Nacl洗脱峰；7-0. 3M Nacl洗脱峰；8-0. 5M Nacl洗脱峰。图3-a-Vasostatin蛋白对HUVEC细胞增殖的影响图3-b-Vasostatin对HUEVC细胞凋亡的影响图 3-c-Vasostatin 抑制 HUVEC 的迁移图3-d. -Vasostatin蛋白对NCI-446细胞增殖的影响图3-e-Vasostatin蛋白对SMMC细胞增殖的影响图3-f-Vasostatin蛋白对BEL细胞增殖的影响图3-g-Vasostatin蛋白对Hela细胞增殖的影响图4-VASS真核表达载体构建其中M-DL2000； 1-PU本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种中试规模制备重组人Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ（ＶＡＳ）蛋白的方法，其特征是，所述方法主要步骤为：１）获取重组人Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ基因；２）将重组人Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ基因插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ；３）构建重组Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ／Ｅ．ｃｏｌｉ．ＢＬ２１工程菌；４）发酵生产重组人Ｖａｓｏｓｔａｔｉｎ蛋白及其复性与纯化。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孟程程，李招发，许瑞安，
申请(专利权)人：华侨大学分子药物学研究所，
类型：发明
国别省市：35
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