本发明专利技术涉及一种具有良好抗癌效果的核桃楸树皮提取物，由以下方法步骤制备获得：（1）将核桃楸树皮用质量分数70~75%的乙醇溶液回流提取3.5~5.5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；（2）将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3:2~0:1的氯仿：甲醇溶液，获得洗脱液。本发明专利技术提取分离获得的核桃楸树皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比现有的其他核桃楸树皮提取物更好的效果，且提取分离方法简单易行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于天然药物领域，具体涉及一种核桃楸树皮提取物及其在制备抗癌药物方面的应用。
技术介绍
在人类寻找新药以及向疾病作斗争的过程中，天然药物的研究和开发发挥着重要作用。有数据表明，在全球应用的175种抗癌药物中，约有57%直接或间接来源于天然产物。因而，从天然植物中寻找和开发新药的前景十分广阔。我国地域辽阔，天然药物资源丰富，如何更加有效的利用这些天然药物资源，开发出能造福于人类的新药，是当前摆在药物研究者面前的重要任务。传统的天然药物研究一般是通过先提取、分离、鉴定植物中的化学成分，然后对得到的化合物进行活性研究。这种方法工作量大，筛选中标率低而且易漏筛， 因而我们首先应用生物活性检测跟踪筛选到最佳组分，后再指导进行活性成分的分离，具有极大地创造性。核桃楸树皮的提取物已被证实在抗癌症方面具有一定的效果。但是核桃楸树皮中的成分非常复杂，在所获得的提取物中哪些是起关键作用，其中起主要抗癌活性的成分有哪些，它们的确切抗癌药效到底如何，这些工作都缺乏系统和深入的探究。另外有关核桃楸抗肿瘤的研究主要集中于天然化学方面，应用的活性检测模型也仅限于动物、组织等。而细胞水平的检测用量少，操作简便，作用机制明确，能更好地反映内外环境综合因素引起的整个机体生理变化，更易于评价药物的作用和药用价值，尤其令人关注的是比较适合较大规模药物筛选，这也是本专利技术专利的创新性所在。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种在抗癌方面具有突出效果的核桃楸树皮提取物。本专利技术的另一个目的在于提供该核桃楸树皮提取物在制备抗癌药物方面的应用。专利技术通过以下技术方案实现上述目的专利技术提供了一种具有良好抗癌效果的核桃楸树皮提取物，由以下方法步骤制备获得 (1)将核桃楸树皮用质量分数7(Γ75%的乙醇溶液回流提取3. 5^5. 5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；(2)将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3:2、1的氯仿甲醇混合液，获得洗脱液。 优选的洗脱剂为体积比5:Γ1:8的氯仿甲醇混合液；更优选的洗脱剂为体积比1:1的氯仿甲醇混合液。步骤(1)所述的核桃楸树皮是干燥的，其重量与所述乙醇溶液体积之间的比例为 30(T800g:5000ml。步骤(1)在进行浓缩时，浓缩至浓缩液是稠膏状的，在浓缩液中加入的水的量相当于浓缩液的Γ7倍体积。采用乙酸乙酯进行萃取时，乙酸乙酯的用量相当于浓缩液的25 45倍体积。并且采用分次萃取，共萃取5 10次。步骤(2)所述的萃取液干燥是通过以下方法实现将萃取液蒸馏至干得到乙酸乙酯提取物，将按重量分数计为20份的乙酸乙酯提取物与7(Γ130份甲醇混合溶解，并加入 20^60份硅胶，研磨后，于4(T60°C下干燥7、小时。本专利技术同时保护了该核桃楸树皮提取物在制备抗癌药物方面的应用。尤其是在制备抗肝癌药物方面的应用。专利技术可以优选以下方案进行 1.提取 取干燥的核桃楸树皮500g，粉碎后置圆底烧瓶中加70%的乙醇5000ml充分浸泡，置电热套中并加冷凝管组成回流系统，反复回流提取3次，每次约1. 5h。使用旋转蒸发仪减压回收乙醇并浓缩提取物至稠膏状，加5倍量水使之溶解分散。采用乙酸乙酯萃取10次，每次乙酸乙酯的用量为300ml。萃取液减压蒸馏至干。2.硅胶柱层析分离取200-300目硅胶约400g，用流动相氯仿1500ml充分浸泡搅拌，除去所有气泡，湿法装柱，轻轻敲打柱壁使其沉降均勻，勿使柱内留有气泡，充分静止30min以上。静止后剪取适当大小滤纸小心置于硅胶柱上层，以此来保护柱层免受扰动。取乙酸乙酯相提取物20g用 IOOml甲醇溶解，倒入研钵中与40g硅胶研磨，50°C干燥箱干燥过夜，次日干法上样。采用氯仿-甲醇梯度洗脱，分别使用氯仿甲醇为1:0，30:1，15:1，7:1，3:1，1:1，0:1得到七组洗脱组份，编号为JMM广7。对每个组份的活性测试表明，氯仿甲醇=1:1洗脱下的组份JMM6显示出较强的肿瘤细胞增殖抑制作用，故取JMM6继续做下一步分析。在核桃楸树皮乙酸乙酯相抗肝癌药用成分的提取、分离中，为了证实专利技术的有效性，专利技术进行了一系列对比试验，并采用人肝癌BEL-7402细胞株作为实验对象检测它们细胞增殖抑制作用。专利技术采用的对比试验如下在萃取步骤中，专利技术采用了几种萃取溶液的对比，分别是石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，各3次，萃取液减压蒸馏至干。分别得到石油醚组份，乙酸乙酯组份，正丁醇组份以及水相。MTT法检测四种萃取相的细胞增殖抑制作用的试验方法为取对数生长期的人肝癌BEL-7402细胞，胰酶消化，加培养基收集并分散成单个细胞悬液，调整细胞浓度4X IO4 个/ml，接种细胞悬液于96孔板，每孔加100 μ 1。将96孔板置C02培养箱中培养12h，加入各提取物不同浓度的工作液，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水相四种萃取相提取物的终浓度分别为500，250，125，62. 5，31. 25和15. 625μ g/ml。乙酸乙酯萃取相经进一步硅胶柱分离后各组分加药作用终浓度分别为200，100，50，25，12. 5,6. 25μ g/ml。对照孔加等体积的 RPMI1640培养液，DMSO终浓度为0. 5%。每组设3个复孔，放置于细胞培养箱(37°C，5%C02) 中分别继续培养24h，48h和72h。每孔加入20 μ 1 5mg/ml的MTT 37°C继续孵育4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光度值(0D值)。计算细胞相对增殖率和IC5(1。采用MTT抗肝癌活性跟踪分离中，对四种萃取相的活性测试表明，乙酸乙酯相组份对人肝癌BEL-7402细胞株显示出最强的增殖抑制效应，故取乙酸乙酯相作为活性组份进行进一步的分离。其中MTT 结果显示，乙酸乙酯相使BEL-7402细胞的存活率逐渐下降，与对照组相比表现出明显的剂量_依赖效应，而且在6. 25-500 μ g/ml的浓度区间中还表现出明显的时间-依赖效应。计算作用 48h 的 IC50 为 0. 15mg/ml。在硅胶柱层析分离一步，专利技术使用了以下梯度的洗脱液氯仿甲醇的体积比分别为1:0，30:1，15:1，7:1，3:1，1:1，0:1的七组洗脱液，分别洗脱得到七组洗脱组份，编号为JMM1-JMM7。MTT结果显示，对于JMM1-JMM7组份，JMM6在用药浓度25-200 μ g/ml分别作用人肝癌BEL-7402细胞株24，48和72h后，均表现出较强的增殖抑制作用， 且呈现出明显的剂量和时间依赖效应。可见洗脱液JMM6，即本专利技术所保护的核桃楸树皮提取物具有突出的抗癌效果。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果1.本专利技术提取分离获得的核桃楸树皮提取物，在抗癌方面尤其是抗肝癌方面，具有比现有的其他核桃楸树皮提取物更好的效果，且提取分离方法简单易行。2.在恶性肿瘤类疾病中，肝癌的致病特点是病情隐匿，恶性度高，临床表现起伏急骤，患者用于此病的治疗需投入较多的人力财力。野生核桃楸树皮药用成分的筛选、分离和制备的研究成果及其产业化运作必将为患者节省大量开支，减轻家庭负担。同时野生核桃楸树皮药用成分等成果的开发和产业化必将受到更广大患者的青睐，其市场潜力非常巨大，因此其经济效本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种核桃楸树皮提取物，其特征在于由以下方法步骤制备获得：（１）将核桃楸树皮用质量分数７０～７５％的乙醇溶液回流提取３．５～５．５ｈ，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；（２）将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比３：２～０：１的氯仿：甲醇溶液，获得洗脱液。
【技术特征摘要】
1.一种核桃楸树皮提取物，其特征在于由以下方法步骤制备获得(1)将核桃楸树皮用质量分数7(Γ75%的乙醇溶液回流提取3. 5^5. 5h，蒸发回收乙醇获得浓缩液，再在浓缩液中加水溶解，用乙酸乙酯进行萃取，获得萃取液；(2)将萃取液干燥后，通过硅胶柱层析分离，所采用的洗脱剂为体积比3 2、 1的氯仿甲醇溶液，获得洗脱液。2.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤(1)所述的核桃楸树皮是干燥的，其重量与所述乙醇溶液体积之间的比例为30(T800g: 5000ml。3.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤(1)所述的浓缩液是稠膏状的，在浓缩液中加入的水的量相当于浓缩液的Γ7倍体积。4.如权利要求1所述的核桃楸树皮提取物，其特征在于步骤(1)所述的乙酸乙酯的用量相当于浓缩液的25 45倍体积。5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张咏莉，陆家政，李红枝，黄清松，崔玉强，汪向升，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：81
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