本发明专利技术公开了一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用。本发明专利技术是通过引物扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M片段，最后通过SpeI和SalI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了IRES序列（G-2A-M-IRES），最后利用SalI-HF和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗及其应用。
技术介绍
目前临床应用的PRRS疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗。由于灭活疫苗免疫效果不理想，而减毒活疫苗又存在毒力返强的可能性。当前PRRS己成为严重危害养猪业的重大传染病之一，疫苗的免疫接种仍是预防与控制PRRS最有效的措施。目前用于预防PRRS的商品化疫苗主要是弱毒苗和灭活疫苗， 但因存在安全隐患或免疫效果差的缺陷，不能提供理想的免疫保护。而被誉为“第三次疫苗革命”DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的基因置于真核表达元件的控制之下，构成重组表达质粒DNA，将其直接导入动物体内，通过宿主细胞表达加工合成抗原分子，从而诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答。虽然DNA疫苗具备许多优势，但是却因接种剂量大和存在与宿主基因组重组的安全隐患在发展受到很多限制。因此，研究更安全、有效的新型疫苗载体对预防和控制PRRS的发生与流行具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗。本专利技术另一目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗，是建立在JEV复制子 (PJEV-REP)上的。所述JEV复制子系统是以改造过的低拷贝质粒pOKM为骨架，在缺失绝大部分结构基因(第165-M02核苷酸)的情况下，构建包括CMV启动子、5’ UTR、C蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽(E25)、所有非结构蛋白、3’ UTR、核酶(HDVr)和polyA序列的基于DNA水平的JEV复制子载体系统。上述JEV复制子系统的构建方法，包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID NO: Γ18所示，从质粒pWF-GFP中扩增片段A，再从JEV的基因组RNA中扩增出片段B、C、D和片段II ,再以片段A和B为模板，通过融合PCR的方法扩增出片段I ；以片段C和D为模板，融合PCR扩增出片段III，将片段I、Π和III定向克隆到低拷贝质粒中，得到基于DNA水平的乙型脑炎病毒复制子载体系统。本专利技术所述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗是将蓝耳病的结构基因GP5与M蛋白插入到基于DNA水平的JEV复制子(pJEV-REP)中，包括CMV启动子、 5'UTRX蛋白N端的前23个氨基酸(C23)、E蛋白C端的NSl蛋白的信号肽、所有非结构蛋白编码区、3’ UTR、核酶、polyA序列、GP5蛋白编码区、FMDV-2A的序列和M蛋白编码区。上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子疫苗的构建方法包括如下步骤设计引物，其序列如SEQ ID N0:19l8所示，扩增出高致病性猪蓝耳病病毒XH株的 GP5和M基因，利用融合PCR的方法，在两个基因中间插入FMDV-2A的序列，从而得到G-2A-M 片段，最后通过SpeI和MlI两个酶切位点克隆到JpJEV-REP ；另外，为了使M蛋白能够产生真实的N末端，G-2A-M片段的下游插入了 IRES序列(G-2A-M-IRES)，最后利用MlI-HF 和SpeI两个酶切位点插入到pJEV-REP中，最终构建基于JEV复制子并且能够表达GP5和 M蛋白的高致病性蓝耳病疫苗。IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示。G-2A-M片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:30所示。本专利技术上述基于DNA水平的高致病性猪蓝耳病病毒JEV复制子能有效表达并能诱发特异性抗体和细胞免疫反应，可作为预防高致病性猪蓝耳病的一种新型基因工程疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果目前市场普遍存在的蓝耳病疫苗弱毒疫苗，但减毒活疫苗最大的缺点是存在毒力返强的可能性，而传统的基因工程疫苗蛋白表达量低，免疫原性较差等不足。而本专利技术研发的复制子疫苗不存在活病毒，因此不存在病毒毒力返强的可能性，另外，本专利技术也证明了与传统的DNA疫苗相比，本专利技术的疫苗可以产生更高的抗体和更强的淋巴细胞增殖反应。附图说明图1为基于JEV复制子载体的猪高致病性蓝耳病疫苗的构建图，其中，A为 JEV-REP-G-2A-M-IRES ；B 为 pJEV-REP-G-2A_M ；图2为GP5基因、M基因及其融合PCR的扩增产物；其中，1为DNA Marker DL2, 000 ； 2为GP5基因PCR片段；3为M基因PCR片段；4为G-2A-M片段；5为G-2A-MR片段；6为 IRES序列PCR片段；7为G-2A-M-IRES片段；图3为各重组质粒的酶切鉴定；其中，1为λ-EcoTH I digest Marker ;2为DNA Marker DL2, 000 ；3 为 pJEV-REP-G-2A-M_IRES (Sall/Spel);4 为 pJEV-REP-G-2A_M (Sail/ Spel);5 为 ρJEV-REP-GFP (Sall/Spel);6 为 pJEV-REP-IRES (Sall/Spel);7 为 pCAGGS-GM (EcoRI 和 XhoI)；图4为表达GP5/M蛋白的三组重组质粒的Wfestern blot检测结果；其中， 1 为 pageRuler Prestained Protein Ladder ；2 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES ；3 为 PJEV-REP-G-2A-M ；4 为 pCAGGS-GM ；5 为 293T 细胞；图5为三组pJEV-REP重组质粒转染细胞48h的IFA结果(X400)；其中，A 为 pJEV-REP-G-2A-M-IRES 转染细胞；B 为 pJEV-REP-IRES 转染细胞；C 为 PJEV-REP-G-2A-M 转染细胞；D 为细胞； 图6为免疫小鼠血清抗体的生长曲线；图7为不同疫苗免疫小鼠的脾脏淋巴细胞特异性增殖反应。 具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。材料=PRRSV-XH株由农业部动物疫病防控重点开放实验室张桂红教授惠赠； Mac 145细胞由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供；8周龄的SPF级BALB/c雌性小鼠购自广东省实验动物中心。实施例1 构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗1.构建猪高致病性蓝耳病复制子疫苗的设计(结构图如图1)通过自行设计的引物(如SEQ ID NO: 19^29所示)，以HP PRRS基因RNA的反转录产物为模板，引物GP5F与GP5R-FMDV2A-R可扩增出GP5基因的完整编码区及2A序列的前45个碱基，结果扩增出大小为648bp特异性片段；引物MF-FMDVF2A-F与MR- MlI则可以扩增出 2A序列的后45个碱基及M基因的完整编码区，扩增出570bp。另外，引物GP5F和MR-&ilI 通过融合PCR的方法扩增出约1，200bp的G-2A-M片段。同时以G-2A-M片段为模板，以 GP5F和MR为引物扩增出约本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于ＤＮＡ水平的高致病性猪蓝耳病病毒ＪＥＶ复制子疫苗，其特征在于将蓝耳病的结构基因ＧＰ５与Ｍ蛋白插入到基于ＤＮＡ水平的ＪＥＶ复制子（ｐＪＥＶ－ＲＥＰ）中，包括ＣＭＶ启动子、５’ＵＴＲ、Ｃ蛋白Ｎ端的前２３个氨基酸（Ｃ２３）、Ｅ蛋白Ｃ端的ＮＳ１蛋白的信号肽、所有非结构蛋白编码区、３’ＵＴＲ、核酶、ｐｏｌｙＡ序列、ＧＰ５蛋白编码区、ＦＭＤＶ－２Ａ的序列和Ｍ蛋白编码区。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：廖明，陈孝明，亓文宝，臧富玉，李红梅，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81
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