ApoA-Ⅰmilano基因药物制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种ApoA-Ⅰmilano基因药物。本发明专利技术公开了一种ApoA-Ⅰmilano基因药物，其特征在于其包含表达如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。本发明专利技术利用腺病毒载体感染效率高，宿主范围广及安全性较好等特点，构建含有ApoA-Ⅰmilano基因重组腺病毒载体，可为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种Ap0A- I milano基因药物。
技术介绍
随着经济的发展，糖尿病发生率逐年上升，而冠心病是糖尿病的主要死因，几乎 90%的糖尿病人死于动脉粥样硬化(尤其是冠脉)并发症。已知HDL (高密度脂蛋白)是一种未来心血管事件的逆指标，提高血浆HDL水平可减轻动脉粥样硬化并逆转病变。ApoA - I是HDL的主要载脂蛋白，HDL的一些功能主要是有ApoA - I执行的。在人类中，胰岛素抵抗和血液中高密度脂蛋白(HDL)及其主要成分载脂蛋白A(ApoA-I)含量的降低密切相关。最近研究表明ApoA-I基因敲除小鼠出现了高血糖及高胰岛素症，葡萄糖耐受实验也显示ApoA-I基因敲除小鼠葡萄糖代谢受到的损害，出现了 II型糖尿病的早期病症，ApoA-I通过与脂联素受体的胞内部分结合激活AMPK信号通路，改善体内的血糖平衡，从而在II型糖尿病中发挥了保护作用。这一研究结果提示apoA-I与糖代谢及机体的胰岛素敏感性直接相关，提高机体中apoA-I的浓度对于缓解糖尿病的病理生理过程可能具有重要意义。ApoA - I milano是野生型ApoA - I的遗传突变体，其中第173号丝氨酸被精氨酸取代，并形成同源二聚体和杂合子二聚体ApoA -II。携有ApoA - I milano的HDL代谢更快，且研究发现ApoA - I milano具有抑制主动脉粥样硬化，减少内膜增厚等作用，与磷酯结合可抑制血小板聚集，促进纤溶，推迟动脉血栓形成等。故ApoA - I milano可能成为非常适合治疗糖尿病及其粥样硬化的药物。专利技术内容本专利技术所要解决的技术问题是提供一种ApoA- I milano基因药物，为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物。为此，本专利技术公开了一种ApoA- I milano基因药物，其特征在于其包含表达如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。在一实施例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在一实施例中，所述腺病毒载体为pShuttle CMV。本专利技术利用腺病毒载体感染效率高，宿主范围广及安全性较好等特点，构建含有 ApoA - I milano基因重组腺病毒载体，可为治疗糖尿病及其粥样硬化的药物提供新的药物，具有广阔的市场前景和较大的经济效益。附图说明图 1 为 EcoR I 酶切鉴定 pShuttle CMV-A I milano 电泳图； 图2为Hind III酶切鉴定pAd CMV-A I milano电泳图3为Not I和EcoR I酶切鉴定pShuttle CMV-GFP电泳图；图4为Hind III酶切鉴定pAd CMV-GFP电泳图； 图 5 为人 ApoA - I miIano Western blotting 图。具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。实施例1. ApoA-I miIano质粒构建人血总RNA逆转录，采用RT-PCR扩增人载脂蛋白A I (ApoA I) cDNA,测序证实后用 Stratagene QuikChange 定点突变试剂盒将 ApoA I-cDNA 突变成 ApoA I milano-cDNA。突变引物序列见下上游5’ -CTGGGCGAGGAGATGTGCGACCGCGCGCGC-3’ 下游5’ -GCGCGCGCGGTCGCACATCTCCTCGCCCAG-3，突变后cDNA双酶切，连入pDNR-LIB-PA，转化大肠杆菌、挑克隆、测序鉴定为 pDNR-LIB-ApoA-I miIano-PA 质粒用于后续试验。实施例2.含目的基因pShuttle质粒的制备2.1 含 ApoA - I milano 表达框的 pShuttle CMV-A I milano 质粒的制备 pDNR-LIB-apoA I milano-PA质粒经限制性内切酶Ml I和Hind III双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒收集纯化含ApoA I milano基因的片断。pSmttle CMV 用限制性内切酶Ml I和Hind III进行双酶切，回收质粒载体片断，与ApoA - I milano 片断进行连接反应。连接产物转化至DH5ci感受态大肠杆菌中，转化菌用卡那霉素筛选，并进行EcoR I酶切鉴定。对酶切鉴定正确的菌种进行保存，并大量制备pShuttle CMV-A I milano 质粒。2. 2含绿色荧光蛋白表达框pShuttle CMV-GFP质粒的制备 pAAV-EFla-GFP-PA质粒经限制性内切酶Kpn I和)(ba I进行双酶切后，纯化回收含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因目的片断。将pShuttle CMV用限制性内切酶Kpn I和)(ba I进行双酶切后，纯化回收质粒载体片段，与GFP片段进行连接反应。将连接产物转化入感受态DH5 α大肠杆菌中，转化菌用卡那霉素筛选单克隆菌落，小量培养提取质粒DNA用限制性内切酶Hind III进行酶切鉴定。对酶切鉴定正确的菌种进行保存，并大量制备pShuttle CMV-GFP质粒。实施例3.含目的基因pAd质粒的制备pShuttle 质粒(pShuttle CMV-A I milano 和 pShuttle CMV-GFP)经 Rne I 酶切线性化后和pAdeasy-Ι质粒在感受态BJ5183大肠杆菌中进行重组，得到对应的pAd质粒(pAd CMV-A I milano和pAd CMV-GFP)0将酶切鉴定正确的质粒转入DH5 α细菌进行大量制备和储存。实施例4.含目的基因腺病毒毒种的制备含目的基因的PAd质粒(pAd CMV-A I milano和pAd CMV-GFP)经I^ac I酶切线性化后，转染入低代次的HEK293细胞中，培养8-12天后，出现明显的细胞病变效应后收集细胞及其上清，得到对应含目的基因的腺病毒毒种(AdV-A I miIano和AdV-GFP)。实施例5.含ApoA I milano基因的腺病毒载体的鉴定从pDNR-LIB-apoA I milano-PA质粒获得含有载脂蛋白A I milano编码基因，插入 pSiuttle CMV 穿梭质粒，获得 pSiuttle CMV- A I milano。该质粒与 pAdeasy-1 质粒重组得到pAd CMV-A I milano。利用质粒序列作图，构建的pShuttle CMV- A I milano 经EcoR I酶切后获得4921bp和;3486bp两个目的片断段(图1中1为EcoR I酶切 pShuttIeCMV-A I milano ;2 为 DNA marker), pAd CMV- A I milano 酶切后获得 8010bp、 5913bp、5322bp、4597bp、3010bp、2985bp、2945bp、2081bp 和 75bp 目的片段(本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种ＡｐｏＡ－Ⅰｍｉｌａｎｏ基因药物，其特征在于其包含表达如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：崔世涛，王明松，吴新天，庄育刚，彭沪，张慧君，曹佳，彭文辉，
申请(专利权)人：上海市第十人民医院，
类型：发明
国别省市：31