胶体金层析法抗Sp100抗体检测试纸制造技术

本实用新型专利技术公开了一种胶体金层析法抗Sp100抗体检测试纸，其包括有样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫由底板的一侧依次向所述底板的另一侧粘贴在所述底板上，其结合垫包被有金标抗体a层和金标抗体b层；硝酸纤维素包被膜上设置有检测线和质控线，检测线包被有Sp100抗原蛋白层，质控线包被有金标抗体c层。本实用新型专利技术采用间接免疫测定法，引入Sp100抗原蛋白，对结合垫和样品垫进行了工艺优化，来实现抗Sp100抗体的高灵敏度、高特异、高准确性的检测性能，为辅助诊断原发性胆汁肝硬化提供参考依据。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本技术属于医学免疫应用领域，具体涉及到利用胶体金免疫层析技术检测抗 SplOO抗体的试纸。
技术介绍
在PBC患者体内可检出多种自身抗体，如抗核抗体(ANA)、抗线粒体抗体(AMA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗肝肾微粒体抗体(LKM-I)抗可溶性酸性核蛋白(SplOO)抗体、抗核膜糖蛋白(Gp210)抗体、抗早幼粒细胞白血病蛋白(PML)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(SLA/ LP)抗体等，其中最主要的抗体是AMA，PBC常伴有高滴度的AMA，病程早期就出现AMA是本病的特点。AMA于1965年由WalRer等在PBC患者血清中用间接免疫荧光法首次发现，其后的研究显示，PBC患者的AMA阳性率可高达90%，此项检测已成为PBC诊断的主要检查项目。 (Neuberger J,Thomson R. PBC and AMA -what is the connection. Hepatology,1999, 29(1)265 271)其AMA-M2在PBC中敏感性可达90%以上，仍有10% AMA-M2阴性的PBC患者需其他的免疫学指标来对这部分患者进行检出(高荣凯.原发性胆汁肝硬化临床分析..中国实用医药.2009,4(1) :116-117.)。除AMA外，一部分患者血清中也存在ANA，血清抗核抗体(ANA)阳性的PBC患者大约占50%左右。PBC患者常见的ANA免疫荧光有细胞核斑型、多核点型、核膜型、着丝点型、核仁型。多核点型和核膜型ANA对PBC患者有较高的特异性，可作为AMA阴性患者诊断 PBC 血清学指标。(Luettig B, Boeker K H, Schoessler W, et al. The antinucIear autoantibodies SplOOand gp210persist after orthotopic liver transplantation in patients with primary biliary cirrhosis . J Hepatol, 1998,28(5) :824-828),其中多核点型的免疫荧光模式，是在除核仁以外的整个细胞核中出现3 20个不同大小的点 (大小 13 IlOym)。SplOO和早幼粒细胞白血病蛋白(PML)均产生多核点型免疫荧光模式，它们定位于核体结构中，为PBC特异性自身抗体的靶抗原。抗SplOO抗体的检出可避免对AMA阴性 PBC患者诊断的遗漏和延误。(邵杰，魏来，王豪，等.原发性胆汁性肝硬化患者中多核点型抗核抗体的检测..世界华人消化杂志，2005，13 (12) :1478-1481.)抗SplOO抗体是PBC 特异性自身抗体，其特异性几乎为100%。(刘妍，闫惠平，檀玉芬等.原发性胆汁性肝硬化患者抗SplOO抗体与核点型抗核抗体的检测· ·临床检验杂志2009，27 (4) :256-258.)SplOO蛋白和PML蛋白共同定位于核点(也称核体)，被称为核点蛋白，二者与PBC 患者血清反应呈现相似的荧光表现一核点型，但二者是完全不同的抗原分子。它们的功能尚不清楚，但其结构包括一个锌指结构和可能具有调节活性的DNA结合域，SplOO还有类似于MHC-I抗原结合部位保守区域的序列。核点蛋白在核上的表达受病毒感染、干扰素等因素的影响。最初的免疫印迹方法表明SplOO抗原是分子量100KD左右的分子，但通过克隆表达得到的是一个编码480个氨基酸组成，分子量为53KD的分子，因其在凝胶电泳时表现为100KD的反常的迁移率，故命名为SplOO。通过基因片段噬菌体展示肽库技术分析SplOO的主要线性表位是四6-311及 332-351两个区域，反应核心分别是SNSKVE/EPLEVFISA。抗SplOO抗体在免疫荧光方法中常表现为多核点型(multiple nuclear dots, MND)，即间期细胞可见3 20多个点状颗粒，大小不同且分布在整个细胞核，胞浆无荧光， 易误为抗着丝点抗体(ACA)，但ACA可使分裂期细胞染色体着色呈现典型表现，其颗粒数目较恒定，且大小均勻。目前以重组SplOO为抗原，用ELISA法检测该抗体，敏感性及特异性都较IIF法提高。Szostechi等检测PBC患者抗SplOO抗体阳性率为31%，而在其他自身免疫病(如 SLE、PSS、MCTD、PM/DM等0中其阳性率< 3% ；AMA阴性PBC患者中有48%出现抗SplOO抗体,提示此抗体对AMA阴性PBC患者的诊断有帮助(Szostecki C, et al. Autoantibodies against，nuclear dots' in primary biliary cirrhosis. Seminars Liver Dis.1997 ； 17(1) :71-78.)Zuchner等在170例PBC患者中发现抗SplOO抗体阳性率21 %，抗PML抗体阳性率13%，荧光显微镜下多核点型(MND型)ANA阳性患者占25%，这类患者肝组织学进展较快经两年的UDCA治疗后，识别全长SplOO的抗体在研究前后没有变化，用IBT法则发现部分PBC患者治疗前后抗体识别的SplOO抗原表位发生变化，这可能是UDCA调节体液免疫作用所致(Zii chner D, et al. Prevalence, kinetics, and therapeutic modulation of autoantibodies against SplOOand promyelocytic leukemia protein in a large cohort of patients with primary biliary cirrhosis.Hepatology. 1997 :26(5) 1123-1130.)。鉴于抗SPlOO抗体在AMA阴性的PBC患者的阳性率可达60%，因此，抗SplOO抗体检测是AMA阴性的PBC患者的诊断具有非常重要的意义。抗SplOO抗体是PBC的特异性自身抗体，该抗体在PBC诊断中特异性高达97-100%，极少出现在其他自身免疫性疾病中，敏感性为20% -30%，可作为PBC的一个重要辅助诊断指标。本技术采用大肠杆菌原核表达克隆化基因获取抗原蛋白SplOO，即为本产品的检测抗原。目前实验室常用的检测抗可溶性酸性核蛋白(SP100)抗体的方法主要有酶联免疫吸附剂试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、间接免疫荧光法(indirect immunoflurescence, IFF) > ^ ^ (immunoblotting test, IBT) > ^^^^^ff fi (Line immuno assay, LIA)等。间接免疫荧光，观察结果需要专业人员操作特殊的仪器设备，间接免疫荧光法存在检测时间长但须有荧光显微镜观察结果，技术程序比较复杂，并有一定的主观人为判断误差，另外易受其他干扰产生假阳性，标准化困难，也不适合高通量标本的检测。酶联免疫吸附法，需多次加样和洗涤步骤，完成整个实验过程需三小时左右。ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵敏度也较高，本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．胶体金层析法抗Ｓｐ１００抗体检测试纸，包括有样品垫（１）、结合垫（２）、硝酸纤维素包被膜（３）、吸水垫（６），所述样品垫（１）、结合垫（２）、硝酸纤维素包被膜（３）、吸水垫（６）由底板（７）的一侧依次向所述底板（７）的另一侧相互搭接粘贴在所述底板（７）上，其特征在于：所述的结合垫（２）包被有金标抗体ａ层和金标抗体ｂ层；所述的硝酸纤维素包被膜（３）上设置有检测线（４）和质控线（５），所述的检测线（４）包被有Ｓｐ１００抗原蛋白层，所述的质控线（５）包被有金标抗体ｃ层。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩永俊，高成秀，张玥，葛文斌，孙宏彬，钱杰，
申请(专利权)人：上海科新生物技术股份有限公司，
类型：实用新型
国别省市：31