本发明专利技术公开了一种甘蓝型油菜BnPABP8启动子及制备方法和应用，步骤：A、引物设计：根据已知序列设计特异性步移引物。B、油菜启动子制备：利用SDS裂解法提取油菜DNA，根据基因组步移试剂盒，进行基因组步移，取5μlDNA用DraⅠ酶切，检测DNA纯度，用四种试剂盒提供的内切酶进行DNA的酶切，并纯化酶切产物，纯化步骤：向酶切液中加入乙醇，沉淀，离心，晾干，用无菌水溶解，纯化完成后加入特异性接头，第一轮PCR反应以GSP1和AP1为引物；第二轮PCR以第一轮PCR反应产物稀释液为模板，以GSP2和AP2为引物扩增，回收纯化第二轮PCR产物，与T载体连接，获得PBnPABP8。PBnPABP8在植物根部、茎部、叶片、花蕾以及花药中的应用。在油菜食用油安全性和利用转基因提高作物抗病，抗逆性，抗倒伏。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程和生物
具体涉及一种甘蓝型油菜&1PABP8启动子(命名为PBnPABP8，以下相同)，同时还涉及一种甘蓝型油菜&1PABP8启动子的制备方法。 本专利技术还涉及含有该启动子或其同源核苷酸序列的载体和涉及利用该启动子在油菜及其它植物基因工程中的应用。
技术介绍
植物启动子在基因的表达调控中起着关键作用。基因表达调控是多种因素综合作用的结果。一般按照一个事件的先后顺序，基因的调控分为转录水平调控、翻译水平调控以及蛋白质加工水平调控等。基因编码的蛋白质和RNA及其次级代谢产物对于维持生物体的整个生命活动极其重要。任何基因表达调控的错误都会对生命造成严重后果。因此，对于基因表达调控的机理研究一直是分子生物学研究的热点。转录水平的调控最为重要。启动子是转录水平调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。在某种程度上，启动子决定了基因表达的时空顺序以及表达强度。所以，研究启动子的功能序列对于基因表达调控机制以及日渐成熟的植物基因工程具有非常重要的意义。启动子在构建能够高水平表达异源表达载体的过程中起到关键作用，它决定了外源基因的转录效率和基因的表达水平。植物转基因育种所用的启动子可分为组成型和特异型两类。组成型启动子驱动的外源基因在转基因植株的所有发育时期和组织中稳定表达。对许多双子叶植物的转化，通常都使用含花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子的质粒载体，而在单子叶植物转化中最常用的是含有水稻肌动蛋白Act启动子，玉米泛素Ubi启动子及35S启动子的质粒载体(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002,23( :52-56)。但是很多时候外源基因在受体植物中的持续高效表达不仅造成生物体内能源的浪费，而且在所有组织中的表达有可能对植株本身具有毒害作用，甚至引起转基因安全问题(Jia S-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advanced of Bioengineer. 1997,17(6) :37-42 ；Morris S H,Adley C. C. Irish public perceptions and attitudes to modern biotechnology :an overview with a focus on GM foods. Trends in Biotechnology, 2001,19(2) :43-48)。因此，诱导型启动子和组织特异性启动子的研究和应用日益受到育种工作者的重视。在转基因植物中鉴定的诱导型启动子包括热激启动子，来源于菠菜硝酸还原酶的诱导型启动子等(关丽英等，转基因植物中外源基因的有效表达及其安全评价。首都师范大学学报。2002,23( :52-56)。但是诱导型启动子的应用也具有一定限制，对受体植物进行的外在条件处理，如热激，激素处理等可能引起生物体内一系列的生理生化反应而不利于植株的正常生长。而且化学调控系统中用作诱导物的甲基脱S皮质醇(dex，dexamethasone)、雌二醇(estradiol)禾口四环素(tetracycline)者β对生态环境有害，不宜用于生产实践。而使用植物体内本身的组织特异性启动子就可以避免这种问题。显然，外源基因的组织特异性表达必将有效提高转基因作物的生物安全性。近年来在这方面已经取得很大成就。在不同组织中特异性表达的各类启动子已不断得到研究(宋扬等，植物组织特异性启动子研究。生物技术通报。2007，(4) :21-24).油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。 随着转基因技术的成熟，转基因油菜必然会面临转基因安全风险的舆论。用在油菜种子中完全不表达的启动子来启动目的基因的表达是解决这个问题的一个可行方法。达到既提高油菜各方面品质，又不引起食用油安全风险的目的。因此，本专利技术开发了一个甘蓝型油菜内源启动子。通过荧光定量PCR检测表明该启动子驱动的内源基因在植株的根、茎、叶片、花蕾、角果中高量表达。通过检测报告基因 ⑶S的表达特征证明启动子驱动的基因在根部、茎部、叶片以及花蕾中高量表达而种子中不表达。我们的结果预示着该基因的启动子在转基因植物中具有相当的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜Pbiipabp8启动子。该启动子的时空表达模式可用于研究基因的表达形式，优点在于，来源于植物内源的组织特异性启动子能够精确定位所调控的基因，驱动目的基因在转基因植物的特定组织或时期表达，避免造成植物自身能源和物质的浪费，提高外源基因在转基因植物中的表达效率，限制其表达部位。可应用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全转基因研究。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜Pbiipabp8启动子的制备方法。该方法通过对甘蓝型油菜基因组进行基因组步移，获得甘蓝型油菜PBnFABP8序列。操作简单，结果稳定可靠。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种含有植物高效表达启动子的重组载体，其含有所述的启动子核苷酸序列。该载体大小适合，在植物中易与转化，所带有的标记基因 GUS表达强度高，容易检测。通过这个载体转化拟南芥可以获得GUS基因在植物中高效表达的拟南芥转基因植株。本专利技术还有一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜？^^·启动子在根部、茎部、 叶片、花蕾以及花药的应用。PBnPABP8的功能能够反映油菜&1PABP8基因的功能，即在发育过程中具有重要功能；在该启动子的驱动下，目的基因主要在植株的根部、茎部、叶片、花蕾以及花药中精细表达，而种子中完全不表达。这一具有组织特异性表达的启动子在植物抗病、 抗倒伏、提高光和作用、含油量、改变花期、改变花瓣颜色、抗逆、人工创建种质资源等基因工程和转基因安全(食用、花粉漂流)中具有应用价值。为了完成上述的目的，本专利技术采用如下技术方案为了获得本专利技术，专利技术人对油菜发育过程中的相关基因进行了深入和全面的研究，结果发现一种新的启动子。该启动子驱动的内源基因在植物的根、茎、叶片、花蕾中高效表达。根据本专利技术的一个方面，上述目的可以通过提供一种启动子来实现，所述启动子能够特异性驱动基因在植物中高效表达，所述启动子含有SEQ ID No. 1核苷酸序列或与SEQ ID No. 1实质上同源的核苷酸序列。根据本专利技术的另一个方面，上述目的可以通过提供含有所述启动子的核苷酸序列的重组载体来实现。根据本专利技术的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述重组载体转化的微生物来实现。根据本专利技术的另一个方面，上述目的可以通过提供用所述微生物转化的转基因植物来实现。1 一种甘蓝型油菜启动子Pbiipabp8的制备方法，其步骤是1. 1ΡΒηΡΑΒΡ8驱动的内源基因的表达模式本专利技术所用油菜为甘蓝型油菜(Brassicanapus L.)。供试材料播种于大田，正常田间管理。从大田生长条件下生长的植株上取根、茎、叶、花蕾，角果每种材料至少取三个重复，每个重复至少一株，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，_80°C保存。利用Trirol 提取试剂盒(购自百泰克，产品号R本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种分离的启动子ＰＢｎＰＡＢＰ８，其序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１ 所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜毅，石磊，董彩华，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83
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