一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，适用于水稻防治水稻黑条矮缩病，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。本发明专利技术通过构建含有水稻黑条矮缩病病毒S8部分片段的RNAi表达载体，利用农杆菌介导的转基因方法将RNAi载体转入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素抗性基因筛选、分化、生根壮苗，获得再生转基因植株和株系。该方法利用RNAi技术，可培育出对黑条矮缩病表现抗性的水稻转基因株系，从根本上解决水稻黑条矮缩病问题，显著增强水稻对该病的抗性，提高经济效益，同时为绿色环保农业提供有力的技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于转基因植物的培育
，属于生物和现代农业
的应用技术。
技术介绍
水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Rice Black-streaked Dwarf Virus,RBSDV)引起的病毒病，主要以灰飞虱为传播介体。该病曾于20世纪60年代广泛发生在我国华东诸省市，此后3年，由于麦田翻耕和早稻移栽等耕作方式的兴起，灭杀了第一代灰飞虱若虫，病害的初侵染受阻，发病面积逐年下降。80年代后，由于扩种小麦，又给本病初侵染创造了有利的寄主条件，致使本病在90年代中期回升流行，在浙江、上海、江苏、安徽、江西和福建省北部等长江中下游地区广泛发生，造成严重的经济损失。近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、江西和福建大规模发生。目前，对水稻黑条矮缩病的防治主要是使用农药防治传毒介体灰飞虱，但由于介体昆虫种群数量大，防治效果不佳。众所周知，培育抗病品种是减轻农作物病虫害最为经济、有效、环保的途径。但目前尚没有筛选出对黑条矮缩病具有较好抗性的水稻品种，一旦黑条矮缩病大规模爆发，在没有抗黑条矮缩病新品种迅速推出的情况下，将会对水稻生产造成巨大经济损失。因此，筛选或创制抗黑条矮缩病种质资源是目前水稻黑条矮缩病品种改良最为迫切的课题。RNA干扰(RNAi，RNA interference)是指在进化过程中高度保守的、有双链 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制。由dsRNA介导的干扰现象作为细胞的一种防御机制可针对性地降解细胞内与之具有同源性的核酸(如病毒的核酸)，达到对病毒的抵抗，同时还调节细胞内编码基因的表达，为利用RNA介导的病毒抗性进行抗病毒基因工程的研究奠定了基础。目前，RNAi已经广泛用于农作物抗病抗虫种质资源的创制。目前还未见利用RNAi技术培育抗黑条矮缩病水稻的报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的就是针对上述水稻黑条矮缩病的研究现状，提供一种利用RNAi 技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下 以SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列作为抗水稻黑条矮缩病的目的基因序列，分别以下述1对引物F1/R1进行PCR扩增，扩增得到黑条矮缩病病毒S8部分片段序列，设计上下游引物5’端引入限制性内切酶位点I和分e I，酶切位点外侧添加4个保护碱基以保证酶切完全，引物序列如下Fl: aaaaGGATCCACCTGTTTGGGCTTCTCA； (SEQ ID NO. 2) Rl: aaaaACTAGTAACCTGCCATAATCATCAC； (SEQ ID NO. 3)3将得到的目的基因序列经限制性内切酶ife // I和分e I酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体P1022，于1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入P1022载体中，形成含正反向重复目的片段的中间载体pl022-S8-2 ；用限制性内切酶分别酶切中间载体P1022-S8-2，以及植物表达载体pl30mbiNoS，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到pl30mbiNos载体中，即为构建成功的植物表达载体pl30mbiNos-S8 ；将植物表达载体pl30mbiNos-S8，利用农杆菌介导法分别转入水稻品种的胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，获得转基因植株。本专利技术所说的方法，具体步骤如下(1)水稻黑条矮缩病毒S8部分片段RNAi载体的构建1)分别以下述F1/R1为引物，水稻黑条矮缩病病毒总RNA为模板，进行PCR扩增获得序列如SEQ ID NO. 1所示的述的S8部分片段序列，再将S8部分片段分别克隆到pMD18_T， 得 pMD-S8 ；2)构建含反向重复序列的中间载体P1022-S8-2①构建含正向序列的中间载体P1022-S8-1将pMD-S8和ρ 1022经BeimH I和分e I酶切获得的片段进行连接，分别得到 P1022-S8-1 ；②构建含反向重复序列的中间载体P1022-S8-2将①中得到的含正向序列的中间载体P1022-S8-1用限制性内切酶酶勒·/ II和损a I 进行酶切，回收酶切的目的条带，将其与BamH I和Spe I酶切pMD_S8获得的S8基因序列进行连接，得到含反向重复目的片段的中间载体，命名为P1022-S8-2;③构建含反向重复序列的表达载体pl30mbiNos-S8BernH HWSac I双酶切含反向重复目的片段的中间载体pl022_S8_2，用同样的限制性内切酶酶切植物表达载体pl30mbiNos，分别回收反向重复序列和植物表达载体片段，T4 DNA连接酶连接，得到的阳性克隆分别为pl30mbiNoS-S8 ；(2)将植物表达载体pl30mbiNoS-S8，利用农杆菌介导法分别转入水稻胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。经过多代自交、分子检测和抗性鉴定，表明所获得的转基因株系对水稻黑条矮缩病具有较好抗性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是本专利技术方法利用RNAi技术，可培育出具有优良抗黑条矮缩病的转基因水稻株系，显著增强水稻对黑条矮缩病的抗性，提高其产量和经济效益。附图说明图1为植物表达载体pl301UbiNos。酶切位点依次为及 /7 I，分e I,Kpn I和feeI。图2为中间载体P1022，其多克隆位点区插入了一段内含子，酶切位点依次为 BamH I, Kpn I, Iba l,Bgl II 禾口 fee I。图3为PCR扩增S8基因目的片段的电泳检测结果图1，DL，2000分子量标记；2-4，以表现黑条矮缩病症状的感病水稻植株mRNA为模板扩增的S8基因片段。图4为含S8基因片段正向序列中间载体pl022-S8-l用及 /7 I和分e I双酶切鉴定电泳检测结果图1，DL，2000分子量标记；2-4，pl022-S8-l用I和分e I双酶切， 其中，2为阴性，3-4为阳性。图5为含S8基因片段反向重复序列中间载体pl022-S8-2用及 /7 /和fee I双酶切鉴定电泳检测结果图l-2，pl022-S8-2用/和fee I双酶切；3，DL，2000分子量标记。图6为含S8基因片段反向重复序列表达载体pl301UbiNos_S8用召affl/7 I和fee I 双酶切鉴定电泳检测结果图1_3，pl301UbiNos-S8用及 /7 I和fee I双酶切；4，DL, 2000 分子量标记。图7为转基因植株的潮霉素基因PCR鉴定1_6，部分转基因植株；7-8，阴性对照； 9，阳性对照；10，DL, 2000分子量标记。图8为实施例3中，转基因株系和对照接毒后黑条矮缩病的发病率。发病率为3 次重复的平均值。不同平均数后的星号表示差异显著水平，**表示0.01水平差异显著。图9为实施例4中，半定量RT-PCR检测接毒鉴定的转基因株系及对照中目标基因表达水平1，DL，2000分子量标记；2，未接种武运粳7号植株；3_4，接种武运粳7号植株； 5-8，分别为RNAil-RNAi4转基本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种利用ＲＮＡｉ技术培育抗黑条矮缩病水稻的方法，其特征在于：　　　分别以下述１对引物Ｆ１／Ｒ１进行ＰＣＲ扩增，从水稻基因中扩增得到黑条矮缩病病毒Ｓ８部分片段，其序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示：Ｆ１：　ａａａａＧＧＡＴＣＣＡＣＣＴＧＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴＣＡ；Ｒ１：　ａａａａＡＣＴＡＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＡＴＡＡＴＣＡＴＣＡＣ；将得到的目的基因序列经不同限制性内切酶酶切形成粘性末端，再用与其相同的限制性内切酶酶切中间载体ｐ１０２２，于１．０％琼脂糖凝胶电泳分离后回收酶切的目的条带，连接克隆入ｐ１０２２载体中，形成含反向重复目的片段的中间载体ｐ１０２２－Ｓ８；用限制性内切酶分别酶切中间载体　ｐ１０２２－Ｓ８，以及植物表达载体ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ，电泳回收目的条带后将含正反向重复序列的目的片段连接到ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ载体中，即为构建成功的植物表达载体ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ－Ｓ８；将植物表达载体ｐ１３０１ＵｂｉＮｏｓ－Ｓ８导入农杆菌，利用农杆菌介导法分别转入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选、分化、生根壮苗，即获得再生转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁国华，周勇，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32