以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法技术

本发明专利技术公开了一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，该方法包括：(1)将花生种子去壳，用蒸馏水冲洗和浸泡；然后消毒，去种皮，切开种子，取含胚的半粒种子，沿胚的子叶节点切去胚芽，得到外植体；(2)将农杆菌接种至YEP液体培养液中，培养过夜；离心收集农杆菌菌体，并重悬于包含乙酰丁香酮的液体MS培养基中，得到侵染液；(3)将待外植体浸浮于侵染液中；取出外植体平铺于共培养培养基中，黑暗培养2-3天；再在光照下培养7-10天，得到共培养后的外植体；(4)将共培养后的外植体移至灭菌砂土中，培养驯化后，移入温室中繁殖。本发明专利技术方法实验周期短，转化效率和存活率高，在不同基因型花生品种间的转化效果稳定；避免了传统共培养法所要求的严格的组织培养技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物转基因
，具体涉及一种基因转化方法，特别涉及一种以花生半片成熟种子为受体的农杆菌介导的非组织培养基因转化方法。
技术介绍
花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油料兼食用作物，是我国主要油料作物和经济作物之一。花生具有丰富的营养价值。在我国，花生产量约占油料作物总产量的1/2。花生属于双子叶植物，是农杆菌的天然宿主，但表现出与多数豆科作物相同的弱点——外源基因导入难度大，这使得花生的转基因育种工作受到一定的限制，进展缓慢。国外从二十世纪四十年代开始花生组织培养研究，我国则从七十年代开始研究， 目前已经建立了多种花生离体培养的再生体系。自1983年第一例转基因植物问世以来，虽然只有二十几年的时间，但植物基因转化的发展却日新月异，硕果累累。自1994年Eapen和George首次报道获得花生转基因植株以来，花生的基因转化方法得到很多改进。在花生转基因研究中，花生基因转化方法对遗传转化是至关重要的，它决定了如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株。花生的转化方法可以分为基于组织培养的基因转化和非组织培养的基因转化。基于组织培养的基因转化是以外植体，如成熟的胚或胚轴、子叶、幼叶，未成熟胚及其胚轴、子叶等为受体接受外源DNA，通过在添加有不同的外源激素的培养基上诱导不定芽或体细胞胚的发生，实现基因转化，其主要有农杆菌介导和基因枪介导两种方法。转化后的受体都要经过组织培养筛选抗性的转化系和再生抗性的转化植株等过程。此过程需要无菌环境、人工光照和控制温度、湿度等培养条件，转化效率一般受到受体基因型、外植体类型、培养筛选方法和再生植株等诸多因素的影响，因此高效组培植株再生技术是基于组织培养的基因转化的必要的前提条件之一。近十几年来，花生的遗传转化随着再生和转化技术的进步取得了一定的进展。目前形成两种主要的花生基因转化技术体系。一种为农杆菌介导基因转化，其以花生幼叶、子叶为外植体诱导不定芽或丛生芽，通过卡那霉素筛选、器官发生再生转化植株；另一种为基因枪介导转化，以未成熟胚或子叶和成熟胚、胚小叶为外植体诱导胚性愈伤组织，通过潮霉素筛选获得抗性转化体细胞胚，再生转化植株。但转化及再生率过低，而且同样的遗传转化体系在不同基因型的花生中转化效果差异明显，不能满足现代基因工程进行遗传育种的需要。基于非组织培养的基因转化方法是不通过组培，其方法有花粉管导入法、子房注射法等，但这些方法的基因转化机制仍存在异议，而且基因的转化受到诸如花期等因素的限制，基因转化时间有一定的局限性。已有不通过组培，直接转化成熟种胚生长点获得转化植株的报道。美国Mckently 等报道将保留一片子叶的种胚划伤接种EHAlOl菌株。直接播种于消毒土内，由种胚接种后直接长出转化株，获得转基因花生植株，但种胚存活率只有15%，在800粒种胚中，只有10 株获得种子，3株为阳性植株。Brar等报道成熟种胚顶端分生组织，经过基因枪用包被含 ⑶S、Bar和番茄斑萎病毒外源基因的金粉轰击，获得8和3个转基因系。不通过组培，通过农杆菌和基因枪转化成熟种胚，由生长点直接获得转化植株获得成功，该项技术不需要组培设备，技术简单，并可缩短选育时间的优点，但仍需要解决存活率低，筛选效率低的问题。综上所述，不管是基于组培或现有的非组织培养的基因转化法，都存在缺陷如再生周期长、存活率低、筛选难度大、在不同基因型花生品种间不稳定和设备昂贵等问题。目前还没有一种高通量、高效率、简便易操作、成本低的花生转基因方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种以花生半片成熟种子为受体的农杆菌介导的非组织培养基因转化方法，以解决现有的花生基因转化方法中再生周期长、转化及再生率低、转化效果不稳定等问题，本专利技术方法通量高、转化效果好、不存在基因型依赖，而且操作简便，成本低。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种，包括如下步骤(1)制备转化的受体将花生种子去壳，用蒸馏水冲洗，再在蒸馏水中浸泡30-60 分钟；然后消毒，去种皮，沿子叶间缝隙切开种子，取含胚的半粒种子，再沿胚的子叶节点切去胚芽(图lc、图2)，得到待转化的外植体；(2)侵染液制备将含有待转化质粒的农杆菌接种至YEP液体培养液中，28°C振荡培养过夜；将YEP液体培养液离心收集农杆菌菌体，并将农杆菌菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体MS培养基中，得到侵染液；(3)转化将待转化的外植体浸浮于侵染液中10-20分钟，然后将外植体和侵染液在真空条件下静置10-20分钟；取出外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基中，黑暗培养 2-3天；再在光照Wh/d的条件下培养7-10天，得到共培养后的外植体；(4)移植将外植体移至灭菌砂土中，培养驯化后，移入温室中繁殖。步骤(1)所述消毒是指将去壳后的花生种子在无菌环境下置于75% (V/V)乙醇中浸泡消毒20-30秒，然后用无菌水冲洗1-2次，再置于0. 1% (W/V) HgCl2溶液中浸泡消毒 8-10min,无菌水冲洗4_5次，滤干；步骤(2)所述农杆菌为菌株EHA105 ；步骤(2)所述待转化质粒为植物表达载体PCAMBIA3301或 pCAMBIA1301-GmFAD3C ；步骤(2)所述液体MS培养基含有100m mol/L的乙酰丁香酮；步骤⑵所述侵染液的浓度为OD6tltl = 0. 6 1. 0 ；步骤( 所述真空条件是指真空度为25_40Kpa ；步骤(3)所述共培养培养基的组成为MS+100uM Acetosyringone (乙酰丁香酮)；步骤(3)所述黑暗培养，其环境温度为M ；步骤⑷所述灭菌砂土的湿度为70 85% ；步骤(4)所述温室，其温度M-30 V、湿度40-60 %。本专利技术原理是子叶节点的细胞层具有高度分化能力，且分裂速度快，此时正是导入外源基因的最佳时期(称之为植细细胞的感受态)。利用植物本身的内源激素使其分化成苗，可以避免外源激素对植物细胞的影响，减少变异，这样具有获得再生植株周期短、不经过脱分化，体细胞无性系变异小、能较好保持受体细胞的遗传稳定性以及转化的外源基因能实现稳定遗传等优点。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本专利技术方法只需常规的菌株培养，无须基因枪等贵重仪器，不需要金粉等昂贵的实验耗材，操作简便易行，实验周期短，转化效率和存活率高，在不同基因型花生品种间的转化效果稳定。(2)本专利技术采用花生半片成熟种子作为农杆菌介导外源基因转化的受体系统，避免了传统农杆菌共培养法所要求的严格的组织培养技术，而且种子具有自然的形态建成能力和遗传传递能力，不存在再生植物的困难。附图说明图1是花生半片成熟种子外植体的制备示意图；其中，Ia-消毒后的完整花生种子；Ib-花生两片子叶；Ic-含胚的子叶，沿子叶节点的位置切开；Id-用作外植体的半片成熟种子。图2是花生成熟种子胚的结构示意图；其中，1-子叶，2-胚，3-未成熟小叶，4-顶端分生组织，5-叶腋分生组织，6-子叶节点，7-胚轴，8-胚根，9-胚根尖。图3是植物表达载体pCAMBIA3301的质粒图。图4是实施例1中转抗除草剂(bar)基因的粤油7号T1代植株PCR鉴定电泳图。图5是实施例1中转抗除草剂(bar)基因的珍珠红一号T1代植株P本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种以花生半片成熟种子为受体的非组织培养基因转化方法，其特征在于包括如下步骤：（１）将花生种子去壳，用蒸馏水冲洗，再在蒸馏水中浸泡３０－６０分钟；然后消毒，去种皮，沿子叶间缝隙切开种子，取含胚的半粒种子，再沿胚的子叶节点切去胚芽，得到待转化的外植体；（２）将含有待转化质粒的农杆菌接种至ＹＥＰ液体培养液中，２８℃振荡培养过夜；将ＹＥＰ液体培养液离心收集农杆菌菌体，并将农杆菌菌体重悬于含有乙酰丁香酮的液体ＭＳ培养基中，得到侵染液；（３）将待转化的外植体浸浮于侵染液中１０－２０温室中繁殖。分钟，然后将外植体和侵染液在真空条件下静置１０－２０分钟；取出外植体，滤干菌液后平铺于共培养培养基中，黑暗培养２－３天；再在光照１６ｈ／ｄ的条件下培养７－１０天，得到共培养后的外植体；（４）将共培养后的外植体移至灭菌砂土中，培养驯化后，移入

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：温世杰，刘海燕，梁炫强，
申请(专利权)人：广东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：81