本发明专利技术公开了一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备方法和应用。鸡抗菌肽Cathelicidin1、Cathelicidin2和Cathelicidin3的核苷酸序列和氨基酸序列如序列表所示。所述抗菌肽的制备方法为固相化学合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是将鸡抗菌肽Cathelicidin1-3成熟肽的编码基因分别克隆到表达载体上，然后导入宿主细胞中表达。本发明专利技术应用基因工程技术在原核宿主细胞中高效表达鸡Cathelicidins抗菌肽，经实验证实该组抗菌肽对多种革兰氏阳性菌、阴性菌均有明显的抑制作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一组鸡Cathelicidins抗菌肽及其制备 方法和应用。
技术介绍
近年来，多种传染性疾病困扰着我国的养殖业，抗生素自发现以来在预防细菌感 染、防治畜禽疾病方面发挥了重要作用，对促进畜牧业生产的快速发展起到了巨大的推动 作用，但长期大量使用抗生素类药物使得病原菌逐步产生耐药性，为疾病防治工作增加了 难度。同时，抗生素引发的药物残留使得动物性食品的安全性问题日益突出，耐药质粒容易 交叉散播传给人类，给人类健康和疾病的预防与治疗带来威胁，为此，国际社会提出减少抗 生素生长促进剂(AGP)使用量或取消某些抗生素的使用。从2006年1月开始，欧盟全面 禁止食品动物使用抗生素类促生长饲料添加剂，并于3月成立预防抗生素抗药性扩大研究 网，随后日本和韩国等发达国家也建立了相应的条例，国际奥委会也要求北京为2008年奥 运会提供符合欧盟要求的抗生素含量极低的安全肉食品。寻求抗生素替代品，研制既能有 效防控畜禽疾病、促进动物生长，又无毒副作用、无残留、不易产生耐药性的绿色兽药和饲 料添加剂，已成为动物营养、食品加工、新兽药研发等领域内面临的重大课题。抗菌肽(antimicrobial peptide)是在诱导条件下，动物免疫防御系统产生的一 类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，是宿主免疫防御系统的一个重要组 成部分。抗菌肽具有高效、广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌(G_)、革兰氏阳性菌(G+)、真 菌、原生生物、有被膜的病毒和肿瘤细胞均表现出较强的活性(Jenssen H，et al. Peptide AntimicrobialAgents. Clin Microbiol Rev, 2006,19(3) :491-511)。而绝大多数抗菌肽对 哺乳动物正常细胞无害，具有不同于传统抗生素的独特抗菌机制，而且对机体无毒副作用、 无残留，这将为解决细菌对青霉素等传统抗生素日益增强的耐药性这一棘手的全球性难题 提供新途径，应用前景十分广阔。迄今已从包括动物、植物、昆虫、原核生物等多种生物体内 分离、鉴定了千余种抗菌活性肽，有几十种抗菌肽已进入临床试验或临床前研究阶段。目前在家禽体内已发现了三大类抗菌肽，即防御素类(Gallinacin)、 Cathelicidin类和肝内表达抗菌肽2 (LEAP-2)。从目前相关研究结果来看，鸡β-防御素在体外对多杀性巴氏杆菌及大肠 杆菌、白色念珠菌、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌等均有抑菌作用(Harwig S S，et al. Gallinacins :cysteine-richantimicrobial peptides of chicken leukocytes. FEBS Lett,1994,342(3) :281-285 ；Evans E W,et al.Antimicrobial activity of chicken and turkey heterophil ρ印tides CHP1,CHP2,THPl,and THP3. Vet Microbiol,1995,47(3-4) 295-303)。Cathelicidins类抗菌肽是最初被发现于哺乳动物的一类结构多变的抗菌肽，因 其在信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的Cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidins 在体外具有强的广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性，包括抗生素抗性菌，有的在450%血清和生理盐浓度下仍有杀菌活性。同防御素一样，Cathelicidins抗菌肽也是宿主 防御系统的重要组成部分，但它们通常更耐盐和溶媒。除了主要的杀灭细菌、真菌和病毒 活性外，Cathelicidins还具有对免疫细胞的趋化作用、抑制组织损伤、促进创伤修复、结 合内毒素、诱导血管生成等多种生物学功能(Zaiou M, et al. Cathelicidins, essential gene-encoded mammalian antibiotics. J Mol Med,2002,80(9) :549-61 ;Ramanathan B, et al. Cathelicidins !microbicidal activity, mechanisms ofaction, and roles in innate immunity. Microbes Infect,2002,4(3) :361-372 ；Carretero Μ, et al, Invitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. J InvestDermatol, 2008,128 (1) :223-236.)。由于具有如此广泛的生物学活性和功能， Cathelicidinds抗菌肽已成为免疫学、分子生物学和生物医药领域内的研究热点，其药用 开发前景十分广阔。然而，家禽体内天然抗菌肽的含量极低，分子量小，分离纯化困难，无法满足需要。 化学合成与基因工程方法就成为获得抗菌肽的主要手段，但化学合成抗菌肽成本太高，也 难以应用于临床；因此，通过基因工程的方法在特定宿主内大量表达抗菌肽就成为一条有 效的途径。但由于抗菌肽本身对原核宿主菌有一定的杀伤作用，不适宜在原核系统中直接 表达，通常采用融合表达或真核表达等方式。大肠杆菌因其遗传背景清晰、易于培养、周期 短、成本低廉而备受青睐，成为目前应用最为广泛的外源基因表达宿主之一，多种抗菌多肽 通过融合形式在大肠杆菌表达系统中成功表达，产物经处理后可产生抗菌活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组具有很强抗微生物活性的鸡抗菌肽Cathelicidinl， 2，3，本专利技术利用基因工程技术从白来航鸡的骨髓组织中克隆出Cathelicidins抗菌肽基 因(CathL-l，-2，-3)cDNA片段，并将其成熟肽编码序列克隆至pET-30a(+)等融合表达载体 中，在E. coliRosetta(DE3)表达菌株中重组表达融合蛋白并对其进行初步鉴定，表达产物 以可溶形式存在，不需蛋白酶切割，经亲和层析方法即可制备一组具有很强抗微生物活性 的鸡重组抗菌肽Cathelicidinl，2，3。本专利技术还公开了该组鸡Cathe 1 icidins抗菌肽的氨基酸序列及编码所述鸡 Cathelicidins抗菌肽的DNA序列。本专利技术同时提供了该组鸡Cathelicidins抗菌肽的基因工程制备方法和固相化 学合成法。本专利技术还进一步公开了该组鸡Cathelicidins重组抗菌肽在制备治疗鸡细菌感 染药物中的用途。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供了如下技术方案本专利技术提供的一组 Cathelicidins抗菌肽，是白来航鸡基因编码的抗菌肽，属于家禽Cathelicidins抗菌肽家 族，它们的这一系列序列被命名为Cathelicidin 1，2，3，其前体蛋白的氨基酸序列(从氨 基端至羧基端)如下Cathelicidinl (SEQ ID NO. 5)Met Leu Ser Cys Trp Val Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Gly Ala Cys A本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一组鸡Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎｓ抗菌肽，其特征是，其为鸡抗菌肽Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ１、鸡抗菌肽Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ２和鸡抗菌肽Ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ３，其核苷酸序列分别如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６和ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１１所述。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，宋敏训，李玉峰，马秀丽，姜亦飞，黄兵，林树乾，于可响，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：88
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