酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法，包括：将蔗糖和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得蔗糖棕榈酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia?pastoris)GS?115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明专利技术通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成蔗糖棕榈酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种。
技术介绍
蔗糖酯作为一种安全的表面活性剂，其表面活性作用和广泛的适用范围已受到人们的关注。日本、美国、欧洲共同体各国、联合国粮农组织(FAO)，世界卫生组织(WHO)及我国均已批准蔗糖酯为食品、化妆品和药物的乳化剂。与一般的表面活性剂不同，蔗糖酯在好氧和厌氧条件下均能生物降解，这使日用工业产品的三废成为环境友好产物。我国蔗糖价格低廉、纯度高，进口棕榈油价格较低，食用安全。因此，其用途不断被开发，市场潜力巨大， 极具发展前景。长期以来，蔗糖酯的化学制备多利用蔗糖直接酯化的方法，由于蔗糖有8个反应活性相近的羟基，所以酯化反应作用位点难以控制，欲得到指定结构的单一产物十分困难， 往往需要冗长的保护和去保护的步骤。脂肪酶是目前蔗糖酯合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，可显著降低蔗糖棕榈酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。一种，包括将蔗糖和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反应10 14小时，分离、纯化制得蔗糖棕榈酸酯。优选的，所述的有机溶剂为叔丁醇。优选的，每升有机溶剂中蔗糖、棕榈酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20 100g、50 100g、l 2g。所述反应置于水浴摇床中进行，水浴摇床转速为150 200转/分钟。优选的，在分离纯化前加入分子筛，继续搅拌反应10 12h，锁住水分，促进酯化反应进一步进行。所述的分离、纯化为离心取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒的原始载体为载体pPIC9K，目的基因为通过连接肽序列连接的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，所述的脂肪酶基因连接载体pPIC9K中MFal信号肽序列的C端。所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115为商业化产品，可从^witrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 号为]\C8164。载体PPIC9K为商业化产品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOXl启动子(Genbank号 Ζ46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。本专利技术通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，酯化转化率在80% 以上。具体实施例方式实施例1制备酵母展示脂肪酶通过人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 号AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为Μ28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，连接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中 pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反应体系为模板DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR缓冲液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，；35个循环(94°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 30秒)， 72 0C 10 分钟。用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成PPIC9K-R0L质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115 发生His 4单位点置换重组，用Ml I对pPIC9K-R0L质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15 μ 1加入到事先准备好的毕赤酵母GSl 15感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500ν，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入约Iml预冷的山梨醇。将上述混勻的电转产物约400μ 1涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5% (体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30°C培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80°C下预冻后再经德国 Christ真空冷冻干燥机干燥Mh，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。实施例2酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯实例1取蔗糖0. 2g、棕榈酸0. 5g，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. Olg，置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50°c，反应1 后加入0. 5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应1 后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4°C结晶得蔗糖棕榈酸酯产品，烘干、粉碎即可。实例2取蔗糖lg、棕榈酸lg，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热 IOmin,然后加入酵母展示脂肪酶0. 02g,置于水浴摇床开始反应，转速为180转/分钟，反应温度保持在，反应1 后加入0. 5g分子筛(孔径小于2nm)，继续反应1 后，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4°C结晶得蔗糖棕榈酸酯产品，烘干、粉碎即可。实施例3采用传统化学法合成蔗糖棕榈酸酯取蔗糖0. 2g、棕榈酸0. 5g，加入含有IOmL叔丁醇的具塞三角瓶，混合、预热lOmin， 置于水浴摇床开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50°C，反应1 后加入0. 5g 分子筛(孔径小于2nm)，继续反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法，包括：将蔗糖和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于５０～６０℃反应１０～１４小时，分离、纯化制得蔗糖棕榈酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５，将所得转化子接种于ＢＭＭＹ培养基中，诱导培养７２～１４４小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体ｐＰＩＣ９Ｋ和依次插入原始载体ｐＰＩＣ９Ｋ中ＭＦα１信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母ＧＳ１１５的细胞壁α凝集素基因组成。

【技术特征摘要】
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法，包括将蔗糖和棕榈酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，于50 60°C反应10 14小时，分离、纯化制得蔗糖棕榈酸酯；所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮晖，周陈伟，迪拉热木，徐娟，王睿之，林吉恒，何国庆，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86