本发明专利技术公开了一种抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术。是以蛇足石杉内生枝顶孢霉(Acremonium?endophytium，保藏号为CCTCC?M206118)为生产菌株，在发酵过程中，通过添加前体物质2-亚甲基-1，3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉碱甲的发酵产量提高12.5％-18.7％。种子培养基配方：玉米粉2％，葡萄糖2％，玉米浆0.8％，酵母粉1％，豆饼粉1.65％，KH2PO4?0.2％，MgSO4.7H2O?0.05％，CaCO3?0.35％，发酵培养基配方：玉米粉4％，麦芽糖2％，玉米淀粉2％，酵母粉1.2％，玉米浆0.6％，豆饼粉1.55％，KH2PO4?0.1％??MgSO4.7H2O?0.06％，NaCl?0.05％，CaCO3?0.4％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术。技术背景2008年6月11日公开的专利技术蛇足石杉内生真菌及其应用(专利申请号 200610119149. 7 ；公开号CN101195804A)公开了一种可以产石杉碱甲的内生真菌——内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)，保藏号为CCTCC M 206118。并涉及到了利用该菌发酵可以生产石杉碱甲的技术应用。目前，国内外有一些机构和个人在开展利用石杉植物的多种内生菌(包括真菌和细菌)发酵生产石杉碱甲的技术研究，但实验研究的成品得率一直非常低下，使其难以进入产业化生产，而我们本技术项目的研究获得了优选的配方和创新工艺，通过添加前体物质2-亚甲基-1，3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉碱甲的发酵产量提高12. 5% -18.7%，具有十分重要的意义。
技术实现思路
石杉碱甲是我国首次从蕨类植物蛇足石杉中分离得到的一种活性物质，它对中枢乙酰胆碱酯酶具有高效、可逆、高选择的抑制作用，有强效、高选择性的抗乙酰胆碱酯酶活性及提高学习和改善老年人记忆功能的作用。由于石杉碱甲仅存在于石杉科植物中，随着石杉碱甲被分离并应用于临床，掀起了研究开发的热潮，人们便开始对石杉科植物进行掠夺式开发，加上该植物对环境要求苛刻、分布星散、生长缓慢、资源更新周期长，使其资源越来越匮乏。中国作为石杉野生资源主要分布区，其商业可开采量不足200吨，远不能满足市场对药源的需求，已成为制约石杉碱甲开发的瓶颈。石杉科植物中存在多种内生真菌，它们与寄主形成共生关系，从蛇足石杉植物中分离的内生枝顶孢霉(Acremonium endophytium)，保藏号为CCTCC M 206118，能够生成与宿主植物相同的活性成分石杉碱甲。我们专利技术了特殊的培养配方和优化发酵条件可以高效生产石杉碱甲。工艺流程1、将保存于低温条件下的石杉碱甲产生菌接种于新鲜的PDA斜面培养基上，28°C 培养4d。2、挑取培养成熟的斜面菌种接种于液体摇瓶种子培养基中J8°C，150-180r/min 条件下恒温振荡培养4-5d。3、将培养好的摇瓶液体种子培养基接种于车间种子罐培养基中二8°C，通气量 1 1WM，培养 3-4d。4、按照发酵培养基配方，准确称取各种原材料，配制好发酵培养基，灭菌冷却后， 接入培养好的液体种子，300C，搅拌转速200-220r/min，种子接入量10 %，全程pH值控制在 6. 0-7. 0，培养 8d。35、发酵前期，通气量控制为1 1. IVVM ；发酵后期通气量控制为1 0. 8VVM。6、在发酵96_120h后，向发酵液中添加0. 05%-0. 065%的前体物质2_亚甲基_1， 3-丙二醇二醋酸酯，可使石杉碱甲的发酵产量提高12. 5% -18. 7%。7、发酵过程中，前期保持发酵液中总糖含量控制在6% -7% ；中期保持半饥饿状态，总糖含量控制在3.5% -4. 5%;后期控制在2.5% -3. 5%;放罐时残糖控制为以下。8、发酵完成后，将发酵液进行预处理，并对产品进行提取和精制。附一、种子培养基配方玉米粉2% 葡萄糖2% 玉米浆0.8% 酵母粉豆饼粉 1. 65% KH2PO4 0. 2% MgSO4. 7H20 0. 05% CaCO3 0. 35%二、发酵培养基配方玉米粉4%麦芽糖2% 玉米淀粉2%酵母粉1.2% 玉米菜0.6% 豆饼粉 1.55% KH2PO4 0. 1 %MgSO4. 7H2 0 0. 06% NaCl 0. 05% CaCO3 0. 4%三、石杉碱甲提取工艺(1)、将发酵处理液在76mmHg，8(TC条件下真空浓缩15-20倍。(2)、加入稀氨水，调节pH值为8. 5-9. 0。(3)、加入氯仿萃取，萃取次数按发酵液中石杉碱甲的含量而定。(4)、分离萃取液，加入NaOH与氯仿液再次萃取。(5),1% HCl与氯仿液反复萃取。(6)、脱色在pH为1-2条件下，用活性炭脱色。(7)、结晶用氯仿萃取并蒸干后，固体物质用丙酮溶解，4_5°C静置24h左右，得到结晶体。(8)、重结晶将得到的第一次结晶体用丙酮溶解，进行重结晶。(9)、将晶体于60°C左右温度条件下烘干，检测，可得纯度为99%以上的纯品。四、工艺成果以该发酵工艺进行实验室生产的石杉碱甲经过高效液相色谱检测含量为 4. 98yg/mL。具体实施方式实施例1 抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术(实施例中要用具体的克数或其它具体的数值)1、将保存于低温条件下的石杉碱甲产生菌接种于新鲜的PDA斜面培养基上，28°C 培养4d。2、挑取培养成熟的斜面菌种接种于液体摇瓶种子培养基中J8°C，150r/min条件下恒温振荡培养4d。3、将培养好的摇瓶液体种子培养基接种于车间种子罐培养基中二8°C，通气量 1 1WM，培养 3d。4、按照发酵培养基配方，准确称取各种原材料，配制好发酵培养基，灭菌冷却后， 接入培养好的液体种子，300C，搅拌转速200r/min，种子接入量10%，全程pH值控制在6. 2， 培养8d。5、发酵前期，通气量控制为1 1. 2VVM ；发酵后期通气量控制为1 0. 9VVM。6、在发酵IOOh后，向发酵液中添加0. 06%的前体物质2_亚甲基-1，3_丙二醇二醋酸酯，可使石杉碱甲的发酵产量提高15.5%。7、发酵过程中，前期保持发酵液中总糖含量控制在6. 2% ；中期保持半饥饿状态， 总糖含量控制在3.6% ；后期控制在2.9% ；放罐时残糖控制为以下。8、发酵完成后，将发酵液进行预处理，并对产品进行提取和精制。附(1)种子培养基配方玉米粉2% 葡萄糖2. 2% 玉米浆0.85% 酵母粉1. 1 % 豆饼粉1.8% KH2PO4 0. 2% MgSO4. 7H20 0. 05% CaCO3 0. 35%(2)发酵培养基配方玉米粉4. 2% 麦芽糖1.8% 玉米淀粉2% 酵母粉1.3% 玉米浆0.65% 豆饼粉 1. 75% KH2PO4 0. 1% MgSO4. 7H20 0. 05% NaCl 0. 05% CaCO3 0. 4%石杉碱甲提取工艺1、将发酵处理液在76mmHg，80°C条件下真空浓缩16倍。2、加入稀氨水，调节pH值为8. 5。3、加入氯仿萃取，萃取次数按发酵液中石杉碱甲的含量而定。4、分离萃取液，加入NaOH与氯仿液再次萃取。5,1% HCl与氯仿液反复萃取。6、脱色在pH为1.75条件下，用活性炭脱色。7、结晶用氯仿萃取并蒸干后，固体物质用丙酮溶解，5°C静置24h左右，得到结晶体。8、重结晶将得到的第一次结晶体用丙酮溶解，进行重结晶。9、将晶体于60°C左右温度条件下烘干，检测，可得纯度为99. 3%的纯品。工艺成果以该发酵工艺进行实验室生产的石杉碱甲经过高效液相色谱检测含量为 4. 45 μ g/mL。实施例2 抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术(实施例中要用具体的克数或其它具体的数值)1、将保存于低温条件下的石杉碱甲产生菌接种于新鲜的PDA斜面培养基上，28°C 培养4d。2、挑取培养成熟的斜面菌种接种于液体摇瓶种子培养基中J8°C，180r/min条件下恒温振荡培养3. 5d。3、将培养好的摇瓶液体种子培养基接种于车本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术，其特征在于包括以下步骤：（１）、将保存于低温条件下的石杉碱甲产生菌接种于新鲜的ＰＤＡ斜面培养基上，２８℃培养４ｄ。（２）、挑取培养成熟的斜面菌种接种于液体摇瓶种子培养基中，２８℃，１５０－１８０ｒ／ｍｉｎ条件下恒温振荡培养４－５ｄ。（３）、将培养好的摇瓶液体种子培养基接种于车间种子罐培养基中，２８℃，通气量１∶１ＶＶＭ，培养３－４ｄ。（４）、按照发酵培养基配方，准确称取各种原材料，配制好发酵培养基，灭菌冷却后，接入培养好的液体种子，３０℃，搅拌转速２００－２２０ｒ／ｍｉｎ，种子接入量１０％，全程ｐＨ值控制在６．０－７．０，培养８ｄ。（５）、发酵前期，通气量控制为１∶１．１ＶＶＭ；发酵后期通气量控制为１∶０．８ＶＶＭ。（６）、在发酵９６－１２０ｈ后，向发酵液中添加０．０５％－０．０６５％的前体物质２－亚甲基－１，３－丙二醇二醋酸酯，可使石杉碱甲的发酵产量提高１２．５％－１８．７％。（７）、发酵前期发酵液中总糖含量控制在６％－７％；中期保持半饥饿状态，总糖含量控制在３．５％－４．５％；后期控制在２．５％－３．５％；放罐时残糖控制为１％以下。（８）、发酵完成后，将发酵液进行预处理，并对产品进行提取和精制。...
【技术特征摘要】
1.抗老年痴呆原料药石杉碱甲的发酵技术，其特征在于包括以下步骤(1)、将保存于低温条件下的石杉碱甲产生菌接种于新鲜的PDA斜面培养基上，培养4d。(2)、挑取培养成熟的斜面菌种接种于液体摇瓶种子培养基中J8°C，150-180r/min条件下恒温振荡培养4-5d。(3)、将培养好的摇瓶液体种子培养基接种于车间种子罐培养基中二8°C，通气量 1 1WM，培养 3-4d。、按照发酵培养基配方，准确称取各种原材料，配制好发酵培养基，灭菌冷却后，接入培养好的液体种子，300C，搅拌转速200-220r/min，种子接入量10 %，全程pH值控制在 6. 0-7. 0，培养 8d。(5)、发酵前期，通气量控制为1 1. IVVM ；发酵后期通气量控制为1 0.8VVM。(6)...
【专利技术属性】
技术研发人员：兰时乐，肖宏，王玲，
申请(专利权)人：湖南佰伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：43
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