本发明专利技术涉及一种亲和温敏双水相体系及其应用，包括：1)制备温敏聚合物PNiPAAm-co-AA二元线型聚合物；2)将上述制备的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成水溶液，加入硫酸铜溶液，反应完成，收集沉淀得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu；3)用上述亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。本发明专利技术亲和温敏双水相体系用于BSA牛血清蛋白的分离纯化。该方法所建立的亲和温敏双水相体系，分相行为好，操作简单，时间短，成相物质可回收利用，有效降低双水相成本，适用于规模化生产需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于双水相体系领域，特别涉及一种亲和温敏双水相体系及其应用。
技术介绍
近年来，由于双水相萃取技术在微生物、有机化合物和金属螯合物的分离和纯化、 预浓集过程中表现出相当好的性能，并有望用于大规模提取和纯化生物活性物质，因此越来越受到人们的关注。由于双水相体系易于放大、传质速度快、节省能耗、工作条件温和、易于实现过程连续化，所以双水相体系在生物技术中的应用越来越广泛。目前，双水相体系主要用于细胞的回收、从发酵液中提取蛋白质产品和酶以及与产物的萃取分离相结合的生物转化等。N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的高聚物聚(N-异丙基丙烯酰胺)简称PNiPAAm，是一种具有最低临界溶液温度(LCST)特性的热敏性智能聚合物材料，由于其大分子侧链上同时具有亲水性的酰胺基-CONH-和疏水性的异丙基-CH(CH3)2，使线型PNiPAAm的水溶液随着外界温度的变化可在其LCST附件发生可逆相变。其相变温度在人体生理温度(37°C ) 附近，具有良好的离子型水溶性、热敏性以及生物相容性，因而在药物控释、酶固定化、免疫分析、生化分离等领域有潜在的应用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种亲和温敏双水相体系及其应用，该双水相体系的制备方法操作简单、条件温和、时间短、成本低且成相聚合物可重复利用，本专利技术的亲和温敏双水相体系能够快速简便的从天然产物中分离纯化蛋白质。本专利技术的一种亲和温敏双水相体系，其制备方法，包括1)将0. 25 2. Og N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)与50 400 μ 1丙烯酸(AA)溶解在15 50ml去离子水中，然后将其置于反应容器中，真空脱气，再加入30 60 μ 1 N，N， N' ,N'-四甲基乙二胺(TEMED)和含有0. 015 0. 120g过硫酸铵(APS)的过硫酸铵水溶液(0. 15 1. 20ml)，通氮气鼓泡后密封，接着在45 55°C恒温水浴中反应30 60min，收集沉淀后得到温敏聚合物PNiPAAm-co-AA 二元线型聚合物；2)将上述的温敏聚合物PNI iPAAm-co-AA配制成浓度为0. 05 0. 10g/ml的 PNIiPAAm-co-AA水溶液，取上述水溶液5 10ml，加入5 IOml浓度为0. 1 0. 2mol/L 硫酸铜溶液，室温下振荡反应1 2h，收集沉淀得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu ；3)用上述亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。上述步骤1)中的N-异丙基丙烯酰胺(NiPAAm)的质量为0. 5 1. Og,丙烯酸(AA) 的用量为100 300 μ 1。上述步骤1)中真空脱气时间为10 30min，氮气鼓泡时间为15 30min。上述步骤1)中加入的四甲基乙二胺(TEMED)为40 50 μ 1，过硫酸铵(APS)用量为 0. 050 0. IOOg0上述步骤2)中在配制好PNIiPAAm-co-AA水溶液后，用lmol/L HCl或lmol/L NaOH 调节上述溶液的PH值为7.0。上述步骤3)中所述的绘制相图采用浊点法。PNiPAAm-co-AA-Cu-葡聚糖4万双水相体系相图的绘制，具体步骤如下将两种成相聚合物-亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万分别制成一定浓度的母液。准确称量一定量亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu母液，加入试管中，然后加入葡聚糖4万母液混合均勻，直到试管开始出现混浊为止，称量加入的葡聚糖4万母液的质量，算出亲和温敏聚合物和葡聚糖4万在双水相体系中的重量百分浓度，再加入适量水，使体系变澄清， 称量加入水的质量，并继续加入葡聚糖4万母液，使体系再次变混浊，如此反复操作，计算到达混浊时亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万在系统中的重量百分含量，则可得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万的双节线相图。本专利技术的一种亲和温敏双水相体系应用于BSA (牛血清蛋白)的分离纯化。所述的BSA的分离纯化，首先要进行BSA分离纯化条件的优化，采用单因素实验进行优化，只改变亲和温敏聚合物、葡聚糖4万、BSA初始浓度及pH值中的一个因素(亲和温敏聚合物浓度的改变范围为2. 5 4. Owt %、葡聚糖4万浓度的改变范围为6 Hwt %、BSA 初始浓度的改变范围为5. O 25. Omg/ml、pH值的改变范围为4. O 8. 0)，探讨亲和温敏聚合物、葡聚糖4万、BSA初始浓度以及pH值对BSA在双水相体系中分配的影响，得出BSA 分离纯化的最优实验条件。本专利技术在PNiPAAm高聚物上共聚丙烯酸(AA)，引入可与金属离子螯合反应的羧基-C00H，然后在PNiPAAm-C0-AA 二元线型聚合物上键合金属离子，从而制得同时具有温度敏感性和亲和特性的聚合物。将这种聚合物引入双水相体系，能有效解决目前双水相体系成本偏高的缺陷，同时保留了双水相本身的优点，使双水相萃取蛋白质更具有商业应用价值。有益效果(1)本专利技术所建立的亲和温敏双水相体系，分相行为好，操作简单，时间短，生物相容性好。(2)本专利技术使用的成相物质可回收利用，大大降低了双水相成本，适用于规模化生产需要。(3)本专利技术分离纯化后的BSA回收率高达80% 90%。 附图说明图1为温敏聚合物PNIPAAm-co-AA的LCST测定曲线；图2为亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu的储存稳定性图；图3为PNiPAAm-co-AA-Cu/葡聚糖4万双水相体系相图；图4为不同条件对BSA分配系数(K)和回收率(Recovery)的影响。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1温敏聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺-丙烯酸共聚物(PNiPAAm-C0-AA)的合成，具体步骤如下将1. Og N-异丙基丙烯酰胺和100 μ 1丙烯酸溶解在25ml去离子水中，置于IOOml 具塞磨口圆底烧瓶中，真空脱气lOmin，加入N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺(TEMED) (60 μ 1) 和0. 6ml过硫酸铵溶液(0. lg/ml)，通氮气鼓泡15min后密封，之后50°C恒温水浴反应 30min。反应结束后，将上层清液轻轻倒出，加入50ml去离子水将沉淀溶解。待沉淀完全溶解后，置于50°C恒温水浴中30min，离心收集聚合物沉淀。重复上述步骤3次，以去除未反应的单体。在最后一次聚合物沉淀过程中可加入0. 2mol/L NaCl溶液来促进聚合物的沉淀， 避免聚合物在沉淀过程中的损失。实施例2将0. 25g N-异丙基丙烯酰胺和50 μ 1丙烯酸溶解在15ml去离子水中，置于反应容器中，真空脱气201^11，加入队队& ,N'-四甲基乙二胺(TEMED) (30 μ 1)和0.15ml过硫酸铵溶液(0. lg/ml)，通氮气鼓泡30min后密封，之后45°C恒温水浴反应60min。反应结束后本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种亲和温敏双水相体系，其制备方法，包括：１）将０．２５～２．０ｇ Ｎ－异丙基丙烯酰胺与５０～４００μｌ丙烯酸溶解在去离子水中，然后将其置于反应容器中，真空脱气，再加入３０～６０μｌ Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四甲基乙二胺和含有０．０１５～０．１２０ｇ过硫酸铵的过硫酸铵水溶液０．１５～１．２０ｍｌ，通氮气鼓泡后密封，接着在４５～５５℃恒温水浴中反应３０～６０ｍｉｎ，收集沉淀后得到温敏聚合物ＰＮｉＰＡＡｍ－ｃｏ－ＡＡ二元线型聚合物；２）将上述的温敏聚合物ＰＮＩｉＰＡＡｍ－ｃｏ－ＡＡ配制成浓度为０．０５～０．１０ｇ／ｍｌ的ＰＮＩｉＰＡＡｍ－ｃｏ－ＡＡ水溶液，取上述水溶液５～１０ｍｌ，加入５～１０ｍｌ浓度为０．１～０．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸铜溶液，室温下振荡反应１～２ｈ，收集沉淀得到亲和温敏聚合物ＰＮｉＰＡＡｍ－ｃｏ－ＡＡ－Ｃｕ；３）用上述亲和温敏聚合物ＰＮｉＰＡＡｍ－ｃｏ－ＡＡ－Ｃｕ和葡聚糖４万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。
【技术特征摘要】
1.一种亲和温敏双水相体系，其制备方法，包括1)将0.25 2. Og N-异丙基丙烯酰胺与50 400 μ 1丙烯酸溶解在去离子水中，然后将其置于反应容器中，真空脱气，再加入30 60μ1 N，N，N' ,N'-四甲基乙二胺和含有0. 015 0. 120g过硫酸铵的过硫酸铵水溶液0. 15 1. 20ml，通氮气鼓泡后密封，接着在45 55 °C恒温水浴中反应30 60min，收集沉淀后得到温敏聚合物PNiPAAm-co_AA 二元线型聚合物；2)将上述的温敏聚合物PNIiPAAm-co-AA配制成浓度为0.05 0. 10g/ml的 PNIiPAAm-co-AA水溶液，取上述水溶液5 10ml，加入5 IOml浓度为0. 1 0. 2mol/L 硫酸铜溶液，室温下振荡反应1 2h，收集沉淀得到亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu ；3)用上述亲和温敏聚合物PNiPAAm-co-AA-Cu和葡聚糖4万构建亲和温敏双水相体系并绘制相图。2.根据权利要求1所述的一种亲和温敏双水相体系，其特征在于步骤1)中所述的 N-异丙基丙烯酰胺的质量为0. 5 1. Og，丙烯酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱利民，凌元清，聂华丽，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31
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