本发明专利技术公开了一种检测维生素C二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤：(1)对维生素C二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus?megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter?oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定；(2)主成分分析；(3)过程分析；利用本发明专利技术的方法可以快速地、准确地将维生素C二步发酵过程中的重要的代谢物检测出来，这些代谢物含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，对发酵过程的改进具有提示性意义。从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的优化提供新的思路和方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工业微生物领域，涉及一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物的变化的方法。
技术介绍
细胞内小分子代谢物是细胞代谢的重要组成部分，中糖类物质是重要的能源物质，脂肪酸则主要用于细胞的能量储备和构成细胞膜，氨基酸是构成蛋白质的基础结构，核苷酸类物质除了构成DNA和RNA之外也参与细胞的信号转导和能量转化过程。随着质谱技术的发展，细胞内小分子代谢物，包括有机酸，氨基酸，醇类化合物，胺类化合物，芳香族化合物及糖类等可以被高通量的检测。由于这种高通量的特点，可以从整体水平上检测细胞在发酵过程中产生的包含上述各类物质的整体代谢水平上的变化。维生素C的二步发酵是由巨大芽孢杆菌和酮古龙酸杆菌共同作用完成发酵的，其内在调控机理尚不明确，这就使优化工业生产过程变得困难，也增加了生产中控制发酵过程的难度，如果通过高通量的代谢物组学的手段了解混菌发酵过程中的物质迁移规律，将有利于揭示两种菌在发酵过程中的相互关系，从而有利于弥补现有过程中的上述不足。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的不足，提供一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法。本专利技术的技术方案概述如下一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C 二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点， 所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的3-5份破碎细胞20_100mg分别置于离心管中，加入 0. 5-2. 0ml-40°C保存的体积浓度为50 %的甲醇水溶液为提取液，并加入10 μ 1_20 μ 1的 0. 07-0. 14mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融2_4次，每次冻0. 5-3. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液0. 5-2. 0ml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶3液，30-40°C水浴，进行肟化反应60-100min ；再加入50-100 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40°C水浴，进行硅烷化反应30-80min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量将1μ 1步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30mX0.25mm i. d.，进样口温度250°C _280°C，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为初始 50°C -80°C保持 anin-5min，以 4°C /min_8°C /min 的速度升到 260°C -300°C，保持;3min-8min，使用EI电离源，源温230°C _260°C，检测器电压2300V-2700V，电离电压 60eV-80eV,电流30 μ Α-50 μ A ；质谱检测范围50_800m/z ；小分子代谢物的鉴定使用NIST 数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4. 1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素C 二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；(2)主成分分析①将步骤⑴获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Markerlynx软件对步骤O)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素C发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析；⑶过程分析将步骤( 得到的候选代谢物中对细胞生理状态具有重要意义物质的含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现其在维生素二步发酵过程中的作用，即对发酵过程改进的提示性意义。利用本专利技术的方法可以快速地、准确地将维生素C 二步发酵过程中的重要的代谢物检测出来，这些代谢物含量的变化规律为了解发酵过程的内在机理提供依据，对发酵过程的改进具有提示性意义。从而为进一步优化发酵过程，提高维生素C产量，降低环境污染提供理论基础。同时也为其他混菌发酵过程的优化提供新的思路和方法。附图说明图1，图1-1为维生素C二步发酵中不同时期的细胞内胞内小分子代谢物的主成分分析结果，图1-2为维生素C 二步发酵过程的主成分分析载荷图。图2为维生素二步发酵过程中与细胞生理状态密切相关的氨基酸的变化图。图3为维生素二步发酵过程中与巨大芽孢杆菌生理状态密切相关的吡啶二羧酸的变化图。图4为维生素二步发酵过程中与吡啶二羧酸变化相似的氨基酸的变化图。图5为维生素二步发酵过程中与细胞内主要核酸类物质变化图。图6为维生素二步发酵过程中与吡啶二羧酸变化相似的核酸类物质降解产物的变化图。具体实施例方式下面的实施例可以使本领域的技术人员更全面的理解本专利技术，但不以任何方式限制本专利技术。下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明实施例1一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C发酵过程中巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)CGMCC No 1. 459和氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)CGMCC No 1. 110细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的5份破碎细胞50mg分别置于离心管中，加入1.0ml-40°C保存的体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液，并加入20 μ 1的0. 07mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融3次，每次冻2. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液1. Oml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入50 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液， 31°C水浴，进行肟化反应90min ；再加入80 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，37°C 水浴，进行硅烷化反应30min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测维生素Ｃ二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤：（１）对维生素Ｃ二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）和氧化葡糖杆菌（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）细胞内的小分子代谢物进行测定：①细胞收集及淬灭：将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选３－５个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得３－５份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物：取步骤①获得的３－５份破碎细胞２０－１００ｍｇ分别置于离心管中，加入０．５－２．０ｍｌ－４０℃保存的体积浓度为５０％的甲醇水溶液为提取液，并加入１０μｌ－２０μｌ的０．０７－０．１４ｍｇ／ｍｌ氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融２－４次，每次冻０．５－３．０ｍｉｎ；离心收集上清得到Ａ液；再次加入体积浓度为５０％的甲醇水溶液为提取液０．５－２．０ｍｌ，混合均匀，离心收集上清，得到Ｂ液，将所述Ａ液和Ｂ液混匀，并冷冻干燥；③衍生化：向步骤②获得的冻干的样品中加入４０－６０μｌ的２０ｍｇ／ｍｌ甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，３０－４０℃水浴，进行肟化反应６０－１００ｍｉｎ；再加入５０－１００μｌ的Ｎ－甲基－Ｎ－三甲基硅烷三氟乙酰胺，３５－４０℃水浴，进行硅烷化反应３０－８０ｍｉｎ；④用气相色谱－飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：将１μｌ步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为ＤＢ－５ＭＳ，所述色谱柱的规格为３０ｍ×０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．，进样口温度２５０℃－２８０℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始５０℃－８０℃保持２ｍｉｎ－５ｍｉｎ，以４℃／ｍｉｎ－８℃／ｍｉｎ的速度升到２６０℃－３００℃，保持３ｍｉｎ－８ｍｉｎ，使用ＥＩ电离源，源温２３０℃－２６０℃，检测器电压２３００Ｖ－２７００Ｖ，电离电压６０ｅＶ－８０ｅＶ，电流３０μＡ－５０μＡ；质谱检测范围５０－８００ｍ／ｚ；小分子代谢物的鉴定使用ＮＩＳＴ数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Ｍａｓｓｌｙｎｘ ４．１软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素Ｃ二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；（２）主成分分析：①将步骤（１）获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；②用Ｍａｒｋｅｒｌｙｎｘ软件对步骤（２）中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素Ｃ发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析；（３）过程分析将步骤（２）得到的候选代谢物中对细胞生理状态具有重要意义物质的含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现其在维生素二步发酵过程中的作用。...
【技术特征摘要】
1. 一种检测维生素C 二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤(1)对维生素C二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(GluconcAacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定①细胞收集及淬灭将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心， 收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；②提取细胞内小分子代谢物取步骤①获得的3-5份破碎细胞20-100mg分别置于离心管中，加入0. 5-2. 0ml-40°C保存的体积浓度为50%的甲醇水溶液为提取液，并加入10 μ 1-20 μ 1的0. 07-0. 14mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混勻；置于液氮中反复冻融2-4次，每次冻0. 5-3. Omin ；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50 %的甲醇水溶液为提取液0. 5-2. Oml，混合均勻，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混勻，并冷冻干燥；③衍生化向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60 μ 1的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液， 30-40°C水浴，进行肟化反应60-100min ；再加入50-100 μ 1的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40°C水浴，进行硅烷化反应30-80min ；④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量将Iyl步骤③获得样...
【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，周剑，崔永涛，孙君伟，
申请(专利权)人：天津大学，河北维尔康制药有限公司，
类型：发明
国别省市：12
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