新型慢性乙肝治疗性DNA疫苗的制备及用途制造技术

本发明专利技术提供了一种新的慢性乙型肝炎治疗性ＤＮＡ疫苗的构建、制备方法及用途。这种新的治疗性ＤＮＡ疫苗应用于临床，具有成本低、使用方便、疗效好等优点，适用于慢性乙型肝炎、部分ＨＢｓＡｇ阳性的肝癌的治疗及部分对乙型肝炎蛋白疫苗不反应的健康人的免疫预防。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及乙型肝炎及肝癌的预防与治疗。更具体地，本专利技术涉及一种新的慢性乙肝治疗性DNA疫苗的制备及用途，及含有该疫苗的药物组合物。国内外常用的乙肝治疗方法，有药物治疗、免疫治疗和肝移植，干扰素仍是唯一被认可对慢性乙肝具有疗效的抗病毒药物，目前也仅有20-40％的近期疗效。研究表明干扰素虽然对于前C区变异的HbeAg阴性患者有一定的疗效，延长治疗可维持疗效，但治疗中断即会引起复发。抗Hbe阳性的慢性乙肝患者经干扰素6个月的治疗后，70％的患者病毒被抑制至血清未检出的水平，但疗效持续短暂，停药后90％的患者病毒重新复制，单一干扰素的治疗对于ALT正常或接近正常的患者其长期疗效也不佳。乙肝疫苗的研究现状(1)血源性疫苗从1975年开始研究人员一直在寻找有效的抗乙型肝炎的疫苗。最早的HBV疫苗是从慢性肝炎病人血浆中纯化的22nm亚病毒，给人注射后有保护作用，但一方面成本高，另一方面来源不足，难以满足需要，还需要逐个在黑猩猩中做安全试验，而且还有感染爱滋病病毒的危险，故实用价值不大。(2)重组抗原疫苗后来发展的有实用价值的疫苗主要为重组亚单位蛋白疫苗，包括在酵母表达系统表达的乙肝病毒表面抗原S蛋白(主要蛋白)疫苗；以及在CHO细胞表达的S蛋白(S protein)和M蛋白(M protein)疫苗，这种疫苗经过了糖基化，已经取得一定的效果。无论血浆来源的亚病毒颗粒疫苗还是重组的亚单位疫苗，尽管具有一定的预防作用，但是对于乙肝慢性患者而言治疗是最关键的，该类疫苗治疗性疗效差，成本高是其明显的缺点。而且由于制备过程相对复杂，成本偏高是不可避免的结果。这样限制了这些疫苗在发展中国家特别是贫困地方的广泛使用，而这些地方恰恰正是乙型肝炎的高发区。除了成本高的缺点外，此类疫苗一般要求冷藏保存及运输，这给疫苗的应用带来不便。而且疫苗免疫2-3次才能达到保护作用，在实际免疫时会有一些不便。在乙型肝炎的流行区，为了阻断母婴垂直传播需要在出生几天内注射乙肝疫苗，但其他疫苗如百日咳、白喉、破伤风疫苗为避免母体抗体的干扰必须稍后使用，这样相应增加了免疫的次数和费用。对于已经罹患乙型肝炎的病人而言，最大的问题是治疗，而不是预防，但目前治疗效果最好的INF-的治疗效果也不尽人意，开发新的治疗手段十分必要。需要研制一种安全、有效、价廉、使用方便的新疫苗，以适应世界范围内的需要。根据目前不同动物模型试验的结果来看，DNA疫苗可能能够达到这一要求，而且能够克服其他疫苗的免疫低反应和不反应问题，接种后对已患乙型肝炎的病人也有一定的治疗作用DNA疫苗是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到机体内，使外源基因在体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。一方面，DNA疫苗导入宿主体内后，被抗原提呈细胞(APC)摄取，表达的蛋白质被细胞内蛋白酶体复合物降解为8～10个氨基酸多肽，多肽被内质网腔上的抗原转运蛋白(TAP)运送进入内质网，在那里与MHC-I类分子及β2-微球蛋白形成三聚体，三聚体移出细胞并定位在细胞膜上，从而诱导MHC-I限制的抗原特异性的CTL，产生细胞免疫；另一方面，胞内表达的蛋白质通过分泌或细胞裂解释放入血，并被专职APC内吞，在内体中被降解为12～18个氨基酸的多肽，与此同时，胞浆内质网合成的MHC-II类分子(含α，β，γ三链)也被高尔基体运至内体，在内体中，γ链被降解，剩余的MHC-II类分子的α，β链与抗原肽结合成抗原肽-II类分子复合物而提呈于APC表面，成为CD4+Th细胞免疫监视的靶位，Th细胞分泌淋巴因子，刺激B细胞转化为浆细胞，产生抗体，诱导了抗原特异性的体液免疫应答。DNA疫苗不仅能全面诱导机体体液及细胞免疫反应，而且能够诱发局部的免疫应答和免疫记忆。如果用基因枪将包裹有DNA疫苗的金颗粒导入粘膜下，即可能被粘膜下丰富的粘膜相关淋巴组织中的淋巴细胞或粘膜上皮细胞摄取并表达，产生的抗原蛋白分子也很容易被局部丰富的APC识别、摄取、加工并提呈给Th细胞，进一步激活局部淋巴滤泡中的B细胞转化为浆细胞和Bm细胞，后者产生免疫记忆，前者可合成IgA，且两个IgA单体由J链连接在一起，通过粘膜时，由粘膜上皮细胞产生的分泌片与双体IgA连接，组成稳定的分泌型IgA随粘膜分泌液一起排出细胞，分布于粘膜表面，在粘膜局部防御感染中起十分重要的作用。此外，与其他类型疫苗不同的是DNA疫苗载体中的非编码免疫刺激序列(immunostimulatory sequences，ISS)具有免疫佐剂功能，可有效诱导Th1应答。ISS由胞嘧啶核苷酸和鸟嘌呤核苷酸(CpG)为基元(motif)组成，在DNA疫苗的质粒载体DNA骨架中，氨苄抗性基因中的两个5′-AACGTT-3′序列就是具有较强活性的ISS。此结构在细菌DNA中比例较高，而在脊椎动物DNA中比例较少，并且，脊椎动物中80％以上的CpG均被甲基化。脊椎动物DNA和细菌DNA的这种显著差别可能是使CpG序列成为免疫刺激信号的基础。ISS可作用于多种免疫活性细胞。1995年，Krieg等发现，经CpG刺激后95％的B细胞进入细胞增殖期，并分泌IgM和IL-6。在体外将ISS作用于人单核/巨噬细胞可显著增加细胞中IFN-α，IFN-β，IL-12以及IL-18的mRNA表达。这些细胞因子的分泌可促进NK细胞活化和IFN-γ的合成，并使Th前体细胞向Th1细胞分化。DNA疫苗具有其他常规蛋白疫苗更优越的特性(1)DNA疫苗既能诱导机体对质粒所编码的抗原产生强烈而持久的体液免疫应答，又能诱导机体产生CTL特异性的细胞免疫应答。(2)DNA疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病的作用。(3)DNA疫苗诱导的针对病原体保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用。(4)DNA疫苗表达的抗原接近天然构象，抗原性强。(5)DNA疫苗相对容易进行大规模生产，成本相对较低，性质比较稳定，便于长途储运，分发等。(6)能联合免疫，即可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将不同抗原基因的多种质粒联合应用，制备多价DNA疫苗。(7)接种途径多样化。既能采用注射方式接种(包括皮内、皮下、肌注、基因枪注射技术)，亦能口服、喷雾接种。作为第三代疫苗，美国FDA已批准等至少十余种DNA疫苗进入临床试验，这预示DNA疫苗在21世纪将成为人类与疾病抗争的有利武器。当然，DNA疫苗应用到临床尚需多方面共同的努力。在不久的将来，DNA疫苗将用于临床各种疾病的防治。治疗性疫苗概念的提出及倍受公众关注大约于二十世纪九十年代中期前后。美国Scripps的Chisari小组在1995年所发表的文章中即提出了therapeuticvaccines。实际上在这之前，已有若干研究小组在从事这方面的研究工作，多采用“vaccine immunetherapy”、“therapeutic application”等来提示其研究工作的性质和目的。1995年左右，随着治疗性疫苗概念的提出，其研究开始为人们所注意，尤其在慢性乙肝方面，Chisari小组治疗性疫苗“Theradigm-HBV”已由动物试验进入临床试验；自身免疫病治疗性疫苗V17TCR多肽疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的慢性乙型肝炎治疗性ＤＮＡ疫苗载体的构建方法，其特征是在ＨＢｓＡｇ和Ｐｒｅ Ｓ２开放读框的前端和启动子之间插入有缺失终止码的热休克蛋白的编码区，构成的表达盒依次包括：启动子序列，缺失终止码的热休克蛋白序列和ＰｒｅＳ２序列，ＨＢｓＡｇ序列，聚腺苷酸化信号序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建莉，张立煌，王青青，
申请(专利权)人：上海海欣生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]