半夏属植物的组培快繁方法技术

本发明专利技术涉及一种半夏属植物的组培快繁方法，属于植物细胞工程技术领域。本发明专利技术将半夏无菌叶片、叶柄以及丛生芽等器官作为接种材料，转接到间歇浸没培养反应器中进行增殖诱导、生根和块茎生成培养两个阶段，增殖培养结束后，在无菌条件下将增殖培养基替换为生根及块茎生成培养基以促进半夏块茎形成。本方法大大提高了半夏种苗生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖率。并且利用反应器生产半夏种苗具有无病原菌，遗传均一稳定等优点。且成活率显著提高，劳动力成本显著降低，为低成本的生产大量高质量的种苗和离体块茎提供保障。在提高半夏属药材种植中的种苗质量的同时降低种苗成本，经济效益明显提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种，属于植物细胞工程
具体涉及一种利用高通量生物反应器进行半夏属及其近似物种组织培养和规模化快繁以获得大批量种苗(块茎)的方法。
技术介绍
年丽(PineIlia spp.)为天南星科植物，其块茎可入药，距今已经有2000多年的药用历史，为我国重要的中药材。野生半夏属药材主要分部于四川、湖北和河南省，其次是江苏、山东、江西和浙江等省。据统计，在558种中药处方中，半夏属药材使用频率为第22 位。现代药理学研究表明，半夏属药材具有燥湿化痰、降逆止咳、消痞散结、抗早孕、抗肿瘤作用、降血脂，护肝和治疗冠心病等多种功效，具有极高的药用价值。近年来，半夏属药材的市场需求量大幅度增长，但由于土地开发、环境污染及过度采挖等原因，野生半夏属药材资源日益枯竭。人工栽培半夏属药材目前普遍存在产量低、有效成分含量低等问题，严重制约了半夏属药材的产业化发展。半夏属植物正常的繁殖主要有种子繁殖、珠芽繁殖和块茎繁殖3种繁殖方式，但由于半夏属植物的种子和珠芽体积小采集不便，且成熟时间很长，所以生产上一般采用块茎繁殖。但块茎繁殖效率很低，块茎、种子、珠芽的总繁殖效率约为1:15-1:20。从少量符合要求的优质半夏属种苗开始自然扩繁和栽培，形成规模需要10年以上甚至更长时间；因此采用传统的块茎繁殖难以满足半夏属植物规模化生产的需求。半夏属植物的这一生物学特征严重制约其生产规模化的发展。加之野生资源的日益枯竭和种植时用种量大的特点导致了半夏属产业的快速发展受到限制。并且由于生产上半夏属植物主要以块茎进行无性繁殖，在连续种植后由于病毒侵染等出现的种质退化已成为半夏属植物生产中最突出的问题。另外，半夏属植物生长还受到各种“种传病害”的危害，如细菌性软腐病一旦发生，往往导致半夏属植物大量减产甚至绝收。以上问题可以利用组培快繁的方法来解决。组培快繁，顾名思义就是对植物进行组织培养实现其快速繁殖的意思。半夏属的组织培养研究始于20世纪80年代，作为种苗生产中一般的生产流程为首先将不同外植体如叶片、叶柄、珠芽和茎尖等灭菌后接种到特定培养基中诱导产生愈伤组织，再将愈伤组织进行诱导产生丛生芽，然后通过不断的丛生芽诱导增殖达到需要的量后进行生根苗的诱导，得到的生根苗取出洗净琼脂后即可以炼苗移栽。通过组培快繁利用优良单株作为扩繁的材料，可获得遗传基础和外观品质形状等重要性状均一的繁殖体，并进一步获得品质均一的原药材，同时通过无性繁殖可有效解决野生变家种过程中的种苗基数问题，保证规模化种植中的优质种苗批量生产问题。同时组织培养过程中可以利用茎尖培养对侵染半夏属的病毒进行脱除，实现复壮的目的。但是传统的组织培养方法得到的半夏属组培苗细弱，在进行炼苗移栽时，对组培苗上附着琼脂的清洗时对其伤害较大，且由于半夏属属于小草本植物，叶片没有角质层保护，因此炼苗成活率大概在50%左右，且在移栽成活后生长一段时间后才能形成小块茎。因此组培苗应用于大田生产时需要严格的驯化条件和管理操作。为了解决炼苗成活率低的问题，本专利技术人团队专利技术了 “一种半夏属离体块茎的高效诱导方法”(ZL 200510049742.4)。相比于一般的组培苗生产，离体块茎的方法生产得到的离体块茎具有较强的抗逆性、储藏性，不需要特殊驯化可直接移栽于大田，不受生产季节限制，可全年生产。并且诱导得到的离体块茎外形大小一致，发生同步性好，可人为控制生长发育。另外可以缩短大田生长周期。但是离体块茎的方法也具有一般组织培养所具有的缺点，主要是要消耗大量的组培容器及琼脂等不可回收的试剂，且接种过程中需要大量的人工来达到获得大量组培苗的目的。从而导致组培苗的成本居高不下。且后续清洗时如琼脂和没有生长活力的根未清洗干净会导致离体块茎腐烂。以上各个技术路线为本专利技术提供了基本的方法和材料，为本专利技术的创造了条件。因此，本专利技术人团队通过综合以上各种半夏属组培技术路线的优缺点，成功应用了植物间歇浸没式培养的方法对半夏属进行了培养。利用间歇浸没培养反应器成功进行其它无性繁殖植物的组织培养的研究已有报道。如申请号为200910114406. 1的“禾丨』用间歇浸没式生物反应器进行甘蔗组织培养快繁”的研究，该专利的专利技术人利用双瓶培养方式对甘蔗进行了组织培养快繁。利用间歇浸没式培养方法进行半夏属属及其近似物种组织培养快繁的方法未见报道和公开应用。间歇浸没培养反应器主要是利用培养液对植物组织的间歇浸没进行培养，浸没时供给植物营养，间歇时提供植物足够的氧气。由于该培养方式较好的解决了玻璃化的问题， 并且营养物质随着对植物组织的浸没可以得到很好的传递，因此间歇浸没培养可以很好的解决植物组织培养中的各种难题。利用传统方法进行种苗生产的自动化水平低、且成本居高不下。而其中很大的一部分是劳动力的成本，如传统的半夏属种苗及离体块茎生产需要经历的初代诱导培养、继代增殖培养、生根培养及离体块茎诱导和后续的炼苗移栽都需要大量的人员来进行工作。其中包括培养基的配制、大量培养瓶的清洗灌装灭菌和耗费劳动力最大的切割转接过程。这些都大大增加了组培生产过程中劳动力的投入。本专利技术人团队专利技术了中国专利申请号为200920116327. X的“间歇浸没植物组织器官的培养反应器”。该反应器包括与与时控器相连的充气泵，还包括储液罐和主反应罐； 充气泵通过进气管与储液罐的进口密封相连，在进气管上设置空气除菌器I ；储液罐的出口通过连接管与主反应罐的进口密封相连，主反应罐上设有气体出口，气体出口与空气除菌器II相连。本专利技术人团队还专利技术了中国专利申请号为201020288879. 1的“间歇浸没的开合式植物生物反应器”。如附图1所示，所述的间歇浸没的开合式植物生物反应器，主要包括时控器1、充气泵2、储液室5和主反应器7等，时控器1通过导线与充气泵2相连，充气泵 2的工作与否由时控器1来控制。储液室5与主反应器7之间依靠玻璃板6相隔离，玻璃板6成弧形，玻璃板6的凹部面朝主反应器7的内腔。主反应器7由主反应室74和可开启的盖子73组成，盖子73与主反应室74之间通过磨砂口 72或螺纹旋口实现密封相连；即，玻璃板6的凹部面朝主反应室74。在盖子73上设置与主反应器7的内腔(即主反应室74的内腔)密封相连通的出口管71，位于主反应器7外的空气除菌器II 8与出口管71密封相连通。在玻璃板6中心处设置一通气小孔63，位于储液室5空腔内的玻璃弯管61与通气小孔63密封地相连通；从而实现储液室5与主反应器7 (即主反应室74)之间依靠玻璃弯管61相连通。在玻璃弯管 61内设置过滤网62，设置过滤网62的目的是为了防止主反应室74内的植物组织通过玻璃弯管61掉入储液室5内。在储液室5的底部设置放液口 52，在放液口 52内设置密封塞 53 ；实验结束后，拔出密封塞53，能从放液口 52排出储液室5内的液体培养基。在储液室5 的侧壁上设有与储液室5内腔密封相连通的进口管51，位于储液室5外的空气除菌器I 4 的一端与进口管51密封相连通、另一端与进气管3密封相连通；进气管3与充气泵2密封相连通。因此要实现半夏属种苗的产业化生产必须进行培养方式的革新。而应用间歇浸没培养反应器进行半夏属的培养可以大大提高生产过程中的自动化程度，减少培养时的人力投入，并且可以大大提高增殖本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种半夏属植物的组培快繁方法，包括外植体选材料的选择和处理、增殖培养、生根及块茎生成、炼苗及离体块茎移栽的步骤，其特征在于在间歇浸没培养反应器进行所述的增殖培养和生根及块茎生成步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈集双，贾明良，张本厚，何珣，刘学威，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：84