一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法，将辣根过氧化物酶吸附在纯化凹土表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料；利用滴涂法将该复合材料修饰到玻碳电极表面，构建成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H2O2。本发明专利技术所采用的生物传感器对过氧化氢有良好的电催化活性，能应用于细胞中H2O2的检测，且具有响应快、线性范围宽、检测限低及重现性好等优点，建立了检测细胞中H2O2的一种新的基于酶传感的电化学方法。
Method for detecting intracellular hydrogen peroxide based on horseradish peroxidase and attapulgite Nanocomposite
A detection method of horseradish peroxidase - attapulgite nanocomposites of hydrogen peroxide in the cell based on horseradish peroxidase adsorbed on purified attapulgite, were prepared by horseradish peroxidase - attapulgite nanocomposites by drop coating method; the composite modified glassy carbon electrode surface to construct a horseradish peroxidase - attapulgite nanocomposites with biological sensor; the sensor is used as the working electrode, H2O2 chronoamperometry detection cell. The biosensor used by the invention has good electrocatalytic activity for hydrogen peroxide detection can be applied to H2O2 cells, and has fast response, wide linear range, low detection limit and good reproducibility, was established to detect the expression of H2O2 in a new kind of method based on electrochemical enzyme sensor.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于酶传感的细胞内过氧化氢的电化学检测方法，特别是涉及一 种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内过氧化氢的检测方法，属于生物传 感和细胞电化学
技术介绍
细胞在代谢过程中不断产生各种活性氧(reactive oxygen species，R0S)，例如 超氧阴离子自由基(02_‘)、羟自由基(·0Η)、脂自由基(R00·)、过氧化氢(H2O2)等。过氧 化氢是其中最为稳定的一种，并且其浓度和0厂、· OH等其他ROS分子密切相关，最新的研 究发现过氧化氢在生命体系的细胞代谢过程中扮演着重要的调节作用。过氧化氢可作为信 号分子或第二信使参与多种因子细胞生物学效应的启动，但同时也可与细胞内的生物大分 子反应，从而直接引起细胞膜脂质过氧化、细胞内蛋白质和酶类变性、核酸DNA损伤等，最 终导致细胞死亡、组织损伤、心血管疾病、肿瘤及神经元退变等多种疾病的发生。因此，发展 一种可靠的、灵敏的检测细胞中过氧化氢的方法在生理学和病理生理学领域有着极其重要 的意义。目前检测过氧化氢的方法主要有荧光法、化学发光法、高效液相色谱法、电子顺磁 共振法和基于酶传感的电化学方法等。然而，细胞水平的H2O2检测仍然受到较多因素制约， 如细胞尺度小、胞内超氧自由基的半衰期非常短、稳态浓度极低以及缺少对H2A有效捕获 的探针等，而且一些传统的分析方法存在取样体积大、质量检测限高、分析时间长、仪器价 格昂贵等不足。在众多的检测方法中，基于酶传感的电化学方法由于其具有灵敏度高、响应 快、样品消耗量小、专一性强、易于制备和小型化等优点而倍受人们关注。基于酶传感的电化学方法是将具有氧化还原特性的蛋白质(酶)固载到某种材料 上并将其修饰到电极表面构建成电化学传感器，通过蛋白质(酶)的电催化性能对底物过氧 化氢进行检测。辣根过氧化物酶由于其结构已知、来源广泛而成为研究催化H2A氧化还原 反应的重要模型酶分子之一。然而，目前所选用的蛋白质载体大都为各类碳材料(如石墨、 碳纳米管、碳纳米纤维、有序碳介孔材料以及石墨烯等)、金属氧化物(多孔氧化铝、氧化锆、 四氧化三铁等)、高分子(如壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、聚苯乙烯、聚乙烯及甲基丙烯酸甲酯 MMA)等。这些固定载体都存在一些不足之处，如虽然碳材料具有良好的导电性能、较强的吸 附能力等优点，但其是否对生物大分子会产生毒害作用从而影响到生物大分子的生物活性 目前仍不是太清楚；而金属氧化物虽具有稳定性好、机械强度高、成本低等优点，但是生物 大分子在其表面已失去原有构象，产生变性，导致固定在其表面的蛋白质(酶)失去生物活 性；天然高分子载体最大的特点是无毒性作用，但是它们存在强度较低、导电性能差、在厌 氧条件下易被微生物分解及使用寿命低等缺点；合成的有机高分子材料由于其化学、物理 性能都有很大的可变性，理论上可以担当任何一种酶的载体，而且比天然高分子化合物的 强度高，但是却存在导电性能差的缺点，这是电化学研究的最大不利因素之一。凹土 (全称凹凸棒石粘土)是一种纳米尺寸的天然化合物，具有表面吸附效应、 浓集效应、吸附定向效应和化学活泼性效应等；凹土表面含有大量能和蛋白质(酶)反应 的-OH基团，可以大大提高和蛋白质(酶)之间的结合力；由于凹土的“沸石型的孔道”结 构，凹土具有大的比表面积和多孔结构，易于和蛋白质(酶)交联提高固定的稳定性；凹土具 有良好的生物相容性与电化学稳定性、良好的机械强度、热稳定性、耐生物降解性以及对蛋 白质(酶)的高度亲和性等特性，这些都是凹土作为蛋白质(酶)的载体并研究它们的电化学 特性的有利条件。以凹土为载体固定辣根过氧化物酶制备辣根过氧化物酶-凹土复合纳米材料，能 保持辣根过氧化物酶的天然结构和生物活性，将所得到的纳米复合材料修饰到玻碳电极表 面得到生物传感器，对过氧化氢有良好的电催化活性；本专利技术建立了一种基于辣根过氧化 物酶-凹土复合材料的检测细胞内H2O2的新方法，在生物电分析化学、细胞学和生理病理学等领域有着重大意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内 H2O2的检测方法，以克服现有细胞水平H2O2检测方法存在的缺陷；通过对纯化凹土进行功能 化处理，得到具有生物传感功能的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，并将其构建成生 物传感器应用于过氧化氢的检测，建立一种基于酶传感的电化学检测巨噬细胞中的H2O2的 新方法。完成上述专利技术任务的技术方案是一种基于辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的细胞内H2O2的检测方法，包括以下步骤1)制备辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料将纯化的凹土超声分散，控制分散液的 PH值使其表面带负电荷，将凹土分散液与辣根过氧化物酶(HRP)混合，利用静电作用将表 面带正电荷的辣根过氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复 合材料(HRP -Attapulgite)；2)制备生物传感器将步骤1)制得的纳米复合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修饰 到玻碳电极表面，制备成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器；3)以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中H202。所述的步骤1)中，辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的制备方法包括以下步 骤1)将提纯过后的凹土加入到0.1 mol/LPBS (磷酸盐缓冲液)溶液中，控制pH值范围在 7 - 7. 5间，超声分散0. 5 - 2小时，得到0. 5 - 5 mg/mL的凹土分散液；2)将凹土分散液与1- 10 mg/mL辣根过氧化物酶PBS溶液(pH 7-7.5)混合，在4 ° C连续搅拌0. 5 - 2小时，通过正负电荷的静电吸引作用，辣根过氧化物酶吸附到凹土表 面，形成辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的悬浊液；3)将辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料悬浊液离心处理15-30分钟，并用去离子 水洗涤，除去表面松散的酶分子，在真空干燥器中晾干，得到辣根过氧化物酶-凹土纳米 复合材料(HRP - Attapulgite)。所述的步骤2)中，辣根过氧化物酶-凹土复合材料生物传感器的制备方法是将 玻碳电极抛光至镜面，然后在超纯水中超声清洗后晾干；将所述的辣根过氧化物酶-凹土 纳米复合材料放入0.1 mol/L的PBS溶液中(pH 7-7. 5)，得到1 mg HRP-Attapulgite / mL均相分散液，将2-10 μ L的该分散液滴加到玻碳电极表面，待溶剂挥发后即得到基于 辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料生物传感器，标记为HRP-Attapulgite/GC电极。所 得到的电极不用时在4° C下保存。按照以上方法制得的辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料，经红外光谱(FTIR)、 紫外光谱(Uv-vis)和圆二色谱(CD)表征证明，吸附后的酶分子仍能保持其天然的二级结 构和生物活性。在辣根过氧化物酶-凹土纳米复合材料的红外光谱上(图1)，可以观察到固 定在凹土表面的辣根过氧化物酶，其特征峰酰胺I (1653 cnf1)和酰胺II (1640 cnf1)的 形状和位置与纯的辣根过氧化物酶(酰胺I 1653 cnf1和酰胺II 1640 cnf1)—致，说明辣 根过氧化物酶在吸附过程中没有变性，仍很好的维持了其天然的空本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种基于辣根过氧化物酶－凹土纳米复合材料的细胞内Ｈ２Ｏ２的检测方法，包括以下步骤：１）制备辣根过氧化物酶－凹土纳米复合材料：将纯化的凹土超声分散，控制分散液的ｐＨ值使其表面带负电荷，将凹土分散液与辣根过氧化物酶混合，表面带正电荷的辣根过氧化物酶分子吸附到凹土表面，形成辣根过氧化物酶－凹土纳米复合材料；２）制备生物传感器：将步骤１）制得的纳米复合材料分散成均相溶液，利用滴涂法修饰到玻碳电极表面，制备成辣根过氧化物酶－凹土纳米复合材料生物传感器；３）以所述的传感器为工作电极，使用计时电流法检测细胞中Ｈ２Ｏ２。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴萍，蔡称心，张卉，屠蕴秋，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：84
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