本发明专利技术公开了一个大豆ADF基因及其在花器官改造中的应用，属于生物技术领域。一种大豆ADF基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ?ID?NO.1。转基因烟草植株的花出现了融合的现象，即两朵花共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，形成花中有花的有趣现象，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊，因此这样的空间分布导致了该表型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看呈两小半且表面较为光滑，有粘性。利用大豆ADF基因获得变异的花器官新材料可应用于重要的经济农作物和观赏性园艺植物的育种工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一个大豆ADF基因GmADFl的应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
肌动蛋白(actin)是真核生物细胞中广泛存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝系统。肌动蛋白骨架对植物高度特异化的细胞如花粉管、叶毛、根毛和气孔保卫细胞的形态发生和功能起着重要作用，同时在高等植物形态发生的细胞分裂和伸长过程中发挥着极为关键的调节作用(Kostei al. , 1999; Dong et al. , 2001) ADF (actin depolymerizing factor)作为一种重要的肌动蛋白结合蛋白，自从1997年Carlier克隆第一个拟南芥ADFl后，越来越多的植物ADF被克隆。众多研究表明ADF可调节肌动蛋白聚合和解离，参与植物细胞形态建成，从而起到调节植株性状的作用，为筛选特定性状的植株提供了理想的候选调控基因。大豆起源于我国，是重要的粮油兼用作物。大豆作为严格自花授粉的作物，其花器较小，花粉粘重，花朵开放时翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，导致花药和柱头不能外露，故造成大豆异花传粉非常困难，同时也使得大豆的杂种优势很难被利用。若能定向改变大豆的花器官结构，使之更利于接受外源花粉，必将大大降低不育系繁殖或杂交制种的成本，使大豆杂交种应用于大面积生产得以实现。因此，从分子水平上挖掘能够影响和控制细胞形态建成的相关基因，并应用于特定器官的改造，如大豆的花器官，具有重要的理论和现实意义。本专利技术从大豆中克隆了 1个影响花瓣位置和数目的基因—iF_/，提出了利用该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的旨在公开GmADFl在花器官改造中的基因工程应用，该基因可作为目的基因导入植物，改变植物的花型，从而进行植物品种改良。技术方案本专利技术所提供的大豆ADF基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1，其表达蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。大豆ADF基因GmADFl的基因工程应用，包括 1) X^GmADFl 的克隆搜索大豆EST库，设计一对引物如下 上游引物5，-TCAGAACCCTCGATCACTCC-3，，见 SEQ ID NO. 3 ； 下游引物5，-CACACTGGAACAAGCAAAGC-3，，见 SEQ ID N0. 4 ； 提取大豆品种拟899叶的总RNA，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增。PCR 反应体系为 25μ L，包含模板 cDNA 1.0 μ L(50ng. μ Γ1) ,IOXTaq 缓冲液 2 μ L，MgCL2 1.2 μ L (25 mmoL. L-1), dNTPsO. 5 μ L (10 mmoL. L-1), Taq 聚合酶 0· 5 μ L (5 U. μ L-1)，上游弓 |物，下游引物各1.0 μ L (lOpmoL. μΓ1)，用ddH20补齐至25 μ L0 PCR反应程序为:95°C 预变性4min，反应共30个循环包括95°C变性50s，56°C退火50s，72°C延伸lmin，最后 72°C保温10 min0再将PCR产物进行克隆至pGEM-Teasy载体，测序后获得具有完整编码区的大豆 GmADFl 的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；2)植物表达载体的构建运用Gateway技术可以快速并高效地将目的序列同时构建到多种与(Gateway技术兼容的载体系统，用于功能分析和蛋白质表达研究。其基本过程如下根据Gateway说明书设计一对过量表达的特异性引物上游引物5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAATGGCAAACG CAGCATCTGGTATGGC -3，，见 SEQ ID NO. 5 ； 下游引物5，_ GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTTGGCCCGGC TTTTGAACAC -3，，见 SEQ ID NO. 6 ；将经PCR扩增并测序后的目的序列与donor vector进行BP反应，得到的entry cLone 再与destination vector (pMDC83)进行LR反应，获得植物表达载体_C83-GmAIWl。3)转基因植株的获得将步骤2)获得的表达载体经过液氮冻融法将其转入根癌农杆菌菌株EHA105，进一步转化烟草。对获得的转基因烟草植株进行PCR，RT-PCR验证后再对阳性植株的表型进行分析。转GmADFl基因烟草植株部分开花提前，花瓣的数目或增加或减少，并且花瓣的空间分布呈多样性。此外，有的花出现了融合的现象，即两朵花共用一套柱头和雄蕊；有的外围花瓣数为5个，但其内部却又长出两个类花瓣，且以上这两种类型的花，其柱头均高过雄蕊， 这样的位置关系导致了该类型的花不能正常授粉；有的花柱头开裂，从正面看呈现三小片且柱头表面有许多小的突起，而对照的柱头从正面看则呈两小半且表面较为光滑，有粘性。有益效果的组织表达分析表明其参与了大豆根，莲，茎尖，叶，花和种子的发育。过量表达 GmADFl的烟草的花器官变化表明GmADFl在花瓣位置和数目及其空间分布方面可能发挥了重要的调控作用。本专利技术公开了该基因进行植物花器官改造的基因工程改良方法。该方法对培育花器官改变的植物品种特别是大豆品种具有一定的作用，可以通过定向地改造植物的花器形态，为重要的经济农作物提高育种效率。利用植物表达载体，将本专利技术的―导入植物细胞，可获得花器官改变的转基因细胞系及转基因植株。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(潮霉素标记物、卡那霉素标记物等)。然而从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。携带有本专利技术GmADFl的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成成熟植株。被转化的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是大豆、黄瓜、番茄、杨树、苜蓿等双子叶植物。4下面结合附图及实施例对本专利技术做进一步说明。 附图说明图1 GmADFl基因的组织表达分析(A) GmADFl在大豆不同组织中的半定量RT-PCR分析；(B) GmADFl在大豆不同组织中的实时荧光定量RT-PCR分析。分别采用半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR技术对不同大豆组织中GmADFl的表达情况进行研究，内参为Actin。图2过量表达GmADFl引起烟草植株花器形状和结构异常A 花药未开裂的野生型烟草(WT)的花，花瓣为5枚；E 花药开裂的野生型烟草(WT) 的花，花瓣为5枚1，K 转GmADFl基因烟草的花，花瓣为6枚，分布不对称；B，F 转GmADFl 基因烟草的花，花瓣为4枚，对称分布；C，G 转GmADFl基因烟草的花，花瓣为5枚，分布不对称；D，J 转GmADFl基因烟草的融合花，花瓣总数仍为5枚，但从中间对分，只有一套雄蕊和柱头且柱头高于雄蕊，致不能正常授粉；H 花瓣内生；L 柱头开裂。具体实施例方式下述实例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种大豆ＡＤＦ基因，其特征在于其核苷酸序列为ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． １。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：喻德跃，何慧，黄方，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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