一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法技术

本发明专利技术属于动物实验模型领域，涉及一种建立鱼类脂肪肝实验模型的方法。包括以下步骤：1）采用腹腔注射的方式，对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后进行养殖；所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为100～200mg/ml；2）养殖过程中，投喂油脂总量为4～6%的配合饲料，养殖2～6周；由于本发明专利技术对草鱼注射硫代乙酰胺引起草鱼肝胰脏组织、细胞损伤，干扰草鱼的脂质代谢和能量代谢，同时投喂适当油脂含量的配合饲料，可以快速地获得脂肪性肝病的试验草鱼。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物实验模型领域，涉及一种建立鱼类脂肪肝实验模型的方法。技术背景鱼类由饲料原因引起的脂肪性肝病(fatty liver disease，FLD)是指以脂肪肝、 脂肪性肝炎、肝纤维化、肝功能衰竭等为主要形式的一类疾病，是影响鱼类生长、健康以及 鱼产品食用安全的主要疾病。主要病理特点是肝细胞、组织脂肪积累特性和肝细胞、组织的 实质性损伤作用；在发病历程方面也显示出“脂肪肝一肝实质性损伤一脂肪性肝炎一肝纤 维化一肝功能衰竭(多器官功能障碍综合症)”的基本过程。研究养殖鱼类饲料源性肝病的 发生机制、发病历程及其影响因素，研究不同的防治对策，研究安全的防治药物或功能性饲 料物质等既具有重要的科学基础理论价值，同时对于合理维护养殖鱼类正常生理健康、保 障养殖鱼类最大的生长潜力、保障养殖渔产品的食用安全、维护养殖生态环境安全等具有 非常重要的意义。脂肪肝、肝损伤的实验模型就是为了研究脂肪肝、肝损伤的发生原因、阐述其发生 和发展的生物学机制、研究进行有效防治对策与技术方法等而建立的实验研究模型，主要 用途有①用于发生和发展机理研究；②用于防治药物、饲料对策的研究。因此，建立鱼类 脂肪肝、肝损伤实验模型的基本目标是研究养殖鱼类脂肪肝的发病原因、发展历程和发生、 发展的机制需要；也是研究有效预防和治疗脂肪肝病的营养与饲料控制方法(如饲料安全 控制、营养素的平衡、饲料配方的优化等)、研究有效的饲料添加物和药物，阐明饲料物质、 药物的作用机理的需要，是研究方法方面的重大进步。鱼类脂肪性肝病研究的最大难点在于不能在可控条件下、在较短的时间内、批量 地、稳定地复制出脂肪性肝病试验鱼。鱼类饲料源性脂肪性肝病实验模型在肝损伤机制、防 治药物的研究具有关键性作用。鱼类脂肪性肝病实验模型建立的关键是能够在实验条件下，比较快速、准确地、稳 定地、批量地复制出脂肪肝、肝损伤的实验鱼类。利用鱼类脂肪性肝病实验模型可以研究其 发生和发展的原因、生物学机制进行科学的实验研究，阐明其发生和发展基本过程、基本的 生物学或化学原理和机制；在此基础上，对防止和治疗研究对象脂肪肝、肝损伤发生、发展 的技术方法、药物等进行研究，再进行研究对象的活体规模化验证、临床实验，实现有效预 防和治疗的目标。现有技术中，在人体医学中关于非酒精性脂肪肝的实验模型研究非常多，包括实 验模型的类型、造模方法、检测指标体系、模型的应用等都有较多的研究，但是关于鱼类肝 损伤的实验模型的研究还处于起步阶段。专利技术目的本专利技术目的是提供。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立 方法，包括以下步骤1)采用腹腔注射的方式，对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后 进行养殖；所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为100 200mg/ml ；2)养殖过程中，投喂油脂总量为4 6%的配合饲料，养殖2 6周，得到草鱼脂肪性肝 病实验模型；所述配合饲料包括鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、小麦、米糠、米糠粕、磷酸二 氢钙、沸石粉、膨润土、豆油，还包括维生素和矿物质预混料；所述鱼粉为秘鲁鱼粉；其中， 按照质量百分比，上述组分的配比为秘鲁鱼粉5 8% ；豆粕6 10% ；菜籽粕15 20% ；棉 籽粕15 20% ；小麦15 Im ；米糠8 10% ；米糠粕4 6% ；磷酸二氢钙1. 8 m ；沸石 粉1. 5 m ；膨润土 1. 5 2%，豆油2 5% ；维生素和矿物质预混料1%。上述技术方案中，步骤1)中，所述草鱼的体重优选为50 300g，每一尾草鱼注射0.2ml硫代乙酰胺的生理盐水溶液。上述技术方案中，步骤1)中，注射前对草鱼进行消毒处理用5%。(质量百分数) 的食盐水浸泡草鱼5min，对鱼消毒，且使鱼处于轻微的麻醉状态，便于注射操作；注射方法 是用纱布包裹草鱼但露出腹部，以45度角度进行腹部注射；注射完毕后草鱼直接放回养 殖桶进行养殖。上述技术方案中，步骤1)中，每一尾草鱼注射0. 2ml硫代乙酰胺的生理盐水溶液， 注射的硫代乙酰胺量为每Ikg草鱼注射硫代乙酰胺250 450mg ；注射液用0. 22 μ m过滤 除菌，4°C冰箱贮存备用，保存期不超过3天。上述技术方案中，步骤2)中所述配合饲料中各组分均为常规饲料原料，所述维生 素和矿物质预混料含有13种维生素，具体为VA、VD3、VK3 VE、VBU VB2、VB6、VB12、VC、泛 酸钙、烟酸、叶酸和肌醇，所述维生素和矿物质预混料中的矿物质包括铜Cu、锰Mn、锌Si、碘1、硒％、钴Co、镁Mg、钾K；所述配合饲料的制作方法为按照配比，将秘鲁鱼粉、豆粕、菜籽 粕、棉籽粕、小麦、米糠、米糠粕、磷酸二氢钙、沸石粉、膨润土、豆油、维生素和矿物质预混料 粉碎后过60目筛，混合均勻，使用饲料制粒机加工成直径1. 5mm或2. 0mm、或2. 5mm不同规 格的颗粒，颗粒的直径与长度比保持在1 2左右；冷却、风干，双层塑料袋封口包装，4°C保 存备用。上述技术方案中，步骤2)中，养殖期间水质条件为水温20 30°C、溶解氧6.0 mg/L以上、pH值7. 0 7. 4、氨氮含量0. 20 0· 40 mg/L、亚硝酸盐氮0. 05 0. 1 mg/L。上述技术方案中，步骤2)中，投喂的频率为一天2 4次，优选地，投喂饲料的时 间为每天8 :00,12 00,17 30各投喂饲料一次，每天投喂量为鱼体体重的3 4%。采用上述技术方案养殖2 6周的草鱼可以产生明显的脂肪性肝病，用于不同的 实验需要。由于上述技术方案运用，本专利技术具有下列优点1、本专利技术对草鱼注射硫代乙酰胺引起草鱼肝胰脏组织、细胞损伤，干扰草鱼的脂质代 谢和能量代谢，同时投喂适当油脂含量的配合饲料，可以快速地获得脂肪性肝病的试验草鱼。 2、本专利技术的技术方案建立模型的时间短，可以在2 6周内得到脂肪性肝病的草 鱼。3、本专利技术的技术方案具有批量建模的规模、且保持较为稳定的模型草鱼成活率在 68%以上，可以获得足够数量的用于不同试验的脂肪性肝病草鱼。4、采用本专利技术的技术方案建立的草鱼脂肪性肝病实验模型稳定性好、可重复，对 于体重在50 300g/尾的草鱼，采用本专利技术的方法建模效果最佳。5、采用本专利技术的技术方案建立模型草鱼的主要病理特征是草鱼肝胰脏脂质代谢 功能紊乱；血清AST/ALT比值在2周就显著性升高、碱性磷酸酶活力显著性下降，显示肝胰 脏实质性损伤显著；肝细胞、肝组织有实质性病理变化；在4周以后出现较为明显的肝胰脏 纤维化病变；大量的脂肪在肝胰脏沉积，肝胰脏脂肪含量显著性增加、达到脂肪肝水平。6、采用本专利技术的方法建立的草鱼脂肪性肝病实验模型成模快、可批量建模、模型 较为稳定、可重复，模型草鱼具备脂肪性肝病特征，可以用于草鱼脂肪性肝病形成机制、发 展病理机制的基础研究，同样适用于防治草鱼脂肪肝、草鱼肝纤维化、草鱼肝功能障碍和衰 竭的药物筛选、饲料添加剂筛选及其作用机制的研究。附图说明附图1为实施例一中对照组正常草鱼肝胰脏组织切片观察结果(X400)； 附图2为实施例一中模型组草鱼肝胰脏组织切片观察结果(X400)。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步描述 实施例一1)选择体重50 300g/尾的试验草鱼，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种草鱼脂肪性肝病实验模型建立方法，其特征在于，包括以下步骤：１）采用腹腔注射的方式，对草鱼一次性注射硫代乙酰胺的生理盐水溶液，注射完毕后进行养殖；所述硫代乙酰胺的生理盐水溶液中硫代乙酰胺的浓度为１００～２００ｍｇ／ｍｌ；２）养殖过程中，投喂油脂总量为４～６％的配合饲料，养殖２～６周；所述配合饲料包括：鱼粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、小麦、米糠、米糠粕、磷酸二氢钙、沸石粉、膨润土、豆油，还包括：维生素和矿物质预混料；所述鱼粉为秘鲁鱼粉；其中，按照质量百分比，上述组分的配比为：秘鲁鱼粉５～８％；豆粕６～１０％；菜籽粕１５～２０％；棉籽粕１５～２０％；小麦１５～２２％；米糠８～１０％；米糠粕４～６％；磷酸二氢钙１．８～２％；沸石粉１．５～２％；膨润土１．５～２％，豆油２～５％；维生素和矿物质预混料１％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶元土，蔡春芳，张宝彤，向超林，殷永凤，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32