本发明专利技术涉及产生Ｌ－谷氨酸的微生物和产生Ｌ－谷氨酸的方法，具体地，通过在培养基中培养其中Ｌ－谷氨酸输出基因ｙｈｆＫ基因的表达增强或过表达的微生物以产生并导致Ｌ－谷氨酸在培养基中累积，并从培养基中收集Ｌ－谷氨酸来产生Ｌ－谷氨酸。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及产生L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸广泛用作调味品(seasoning)等的 原料。
技术介绍
L-谷氨酸主要利用产L-谷氨酸细菌通过发酵产生，所述细菌包括属于短杆菌属 (Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或微杆菌属(Microbacterium)的棒 状细菌，或其突变株(Kunihiko Akashi 等，Amino AcidFermentation, Japan Scientific Societies Press，pp. 195-215，1986)。也已报导了用其他微 生物通过发酵产生L-谷氨酸的方法，U.S.专利No. 3，220，9 报导了用属于芽孢杆菌属 (Bacillus)、链霉菌属(Str印tomyces)、青霉属(Penicillium)等的微生物产生L-谷氨 酸的方法。U.S.专利No. 3，563，857报导了用属于假单胞菌属(I^eudomonas)、节杆菌属 (ArthrcAacter)、沙雷氏菌属Gerratia)、念珠菌属(Candida)等的微生物产生L-谷氨 酸的方法。JP32-939;3B报导了用属于芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、产气气杆菌 (Aerobacter aerogenes)(现在禾尔为产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes))等的微生物 产生L-谷氨酸的方法。JP5-M4970A报导了用大肠杆菌(Escherichia coli)突变株产生 L-谷氨酸的方法。此外，US6，197，559、US6，331，419和欧洲专利公开No. 0999282中报导了 用属于克雷伯氏菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)或肠杆菌属 (Enterobacter)的微生物产生L-谷氨酸的方法。另外，已公开了用重组DNA技术增强L-谷氨酸生物合成酶活性以增强L-谷 氨酸产生能力的方法。例如，据报导，通过导入源自大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)的编码柠檬酸合成酶的基因，可以有效地提高棒状杆菌属 或短杆菌属细菌(JP7-1212^B)产生L-谷氨酸的能力。另外，还报导了通过导入源自棒状 杆菌属细菌的柠檬酸盐合成酶基因，可以有效地提高属于肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏 菌属、欧文氏菌属、或埃希氏菌属的肠细菌(欧洲专利公开No. 0999282)的L-谷氨酸产生 能力。通过修饰物质的摄入或输出系统而提高细菌产生物质如氨基酸的能力的方法是 已知的。作为修饰物质摄入系统的方法，例如去除或减少物质的细胞摄入的方法是已知的。 具体地，通过缺失gluAB⑶操纵子或其部分(欧洲专利公开No. 1038970)以去除或减少 L-谷氨酸的细胞摄入，或者减少嘌呤核苷酸的细胞摄入以增强嘌呤核苷酸的产生能力(欧 洲专利公开No. 1004663)等，以此来提高L-谷氨酸产生能力是已知的。修饰输出系统的方法包括增强目标物质的输出系统和去除或减少目标物质生物合成系统中的中间产物或底物的输出系统。例如，已经报导了利用棒状杆菌属细菌 菌株产生L-赖氨酸的方法，在所述菌株中L-赖氨酸输出基因(IysE)的表达得到增强 (W097/23597)。此外，还报导了用微生物产生L-氨基酸的方法，在所述微生物中，rhtA，B， 和C基因的表达得到增强(欧洲专利公开No. 1013765)。据报导这些基因与L-氨基酸的输 出有关。作为去除L-谷氨酸生物合成系统中的中间产物或底物的输出系统的方法，突变或 破坏2-酮戊二酸透性酶Q-oxoglutarate permease)基因以减少2_酮戊二酸的输出是已 知的，2-酮戊二酸是L-谷氨酸生物合成的中间产物(W001/05959)。另外，还披露了培养微生物的方法(W000/37647)，其中用编码ATP结合盒超家族 (ATP binding cassette superfamily) (ABC转运蛋白)的基因修饰了通过细胞膜的氨基酸 转运，所述ATP结合盒超家族与底物通过细胞膜的渗透有关。据报导，在棒状杆菌中，添加生物素或表面活性剂可改变细胞膜的渗透性，并由此 使L-谷氨酸从细胞内部输出，这显示棒状杆菌中L-谷氨酸的输出并非由任何输出基因 介导(Eiichiro Kimura, Metabolic Engineering ofGlutamate Production， Advanced Biochemical Engineering Biotechnology，79 :37_57，2003，Springer Verlag)。此夕卜，还 报导了在埃希氏菌属细菌中，通过增强yfiK基因的表达，L-谷氨酸产生效率得到提高，认 为yfiK基因与L-氨基酸输出有关(欧洲专利公开1016710)。然而，尚未报导泛菌属微生物或其他微生物的L-谷氨酸输出基因，期望发现新的 L-谷氨酸输出基因。或者，在酸性条件下，培养微生物以产生并沉淀L-谷氨酸的方法是已知的(欧洲 专利公开1078989)。其中去除或减少了 2-酮戊二酸脱氢酶活性的肠杆菌属细菌常用于 L-谷氨酸沉淀的发酵产生(欧洲专利公开1078989)。通常，在输入细胞后，L-谷氨酸由谷氨 酸脱氢酶一步转化为TCA循环中间产物，2-酮戊二酸，因此一般认为输入到细胞中的L-谷 氨酸很容易被代谢。然而，当在L-谷氨酸沉淀条件下培养2-酮戊二酸脱氢酶失活或活性降 低的微生物时，不带电荷的游离L-谷氨酸比例增高，容易通过细胞膜，使细胞内L-谷氨酸 浓度增加，因此细菌细胞生长减慢。欧洲专利公开1078989中，通过突变处理培养了能够有 效产生并沉淀L-谷氨酸的2-酮戊二酸脱氢酶缺陷菌株，并用于L-谷氨酸的产生。然而， 除了上述菌株外，很少报导能够产生同时也沉淀L-谷氨酸的菌株，也没有报导在沉淀L-谷 氨酸的条件下能够赋予宿主微生物L-谷氨酸抗性和L-谷氨酸产生能力的基因。yhfK基因是存在于大肠杆菌(Escherichia coli)基因组上的基因Science， 277(5331) =1453-74,1997)，已报导其编码根据预测的氨基酸序列的基序、拓扑学等推定的 转运蛋白(J. Mol. Microbiol. Biotechnol.，2 (2) 195-198，2000)。然而，先前既没有关于 基因的克隆也没有关于基因的表达分析的报导。此外，基因的实际功能也仍然是未知的。专利技术概述本专利技术的目的是提供能够有效地产生L-谷氨酸的微生物，也提供用这样的菌株 有效地产生L-谷氨酸的方法。本专利技术的专利技术人进行了广泛的研究以达到上述目的，结果，他们得到了 L-谷氨酸 输出基因yhfK，其同样赋予L-谷氨酸抗性。专利技术人还发现在yhfK基因表达增强的菌株中， 细胞内L-谷氨酸浓度降低，用这样的菌株提高了 L-谷氨酸产生能力。本专利技术的目的是提供具有产生L-谷氨酸能力的微生物，其中所述的微生物经修饰增强了 yhfK基因的表达。本专利技术的另一目的是提供上述的微生物，其中通过增加yhfK基因的拷贝数或修 饰所述yhfK基因的表达调控序列增强了所述yhfK基因的表达。本专利技术的又一目的是提供上本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有产生Ｌ－谷氨酸能力的微生物，其中所述微生物经修饰使得来自大肠杆菌或菠萝泛菌的ｙｈｆＫ基因的表达增强，其中通过增加所述ｙｈｆＫ基因的拷贝数或者通过修饰所述ｙｈｆＫ基因的表达调控序列增强了所述ｙｈｆＫ基因的表达，其中所述微生物是菠萝泛菌（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：原吉彦，泉井裕，伊藤久生，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[]
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