一种两性霉素B纳米制剂制造技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，是抗真菌药两性霉素Ｂ（ＡｍＢ）的一种纳米制剂。本发明专利技术以聚氰基丙烯酸正丁酯（ＰＢＣＡ）为ＡｍＢ的载体材料制备而成，经动物实验证实，能够透过血脑屏障，测得脑组织内药物浓度高于临床应用的ＡｍＢ脂质体制剂。疗效学实验结果显示，本发明专利技术的纳米制剂能够显著延长隐球菌性脑膜炎小鼠的生存期，使脑组织内感染菌量降低，疗效优于ＡｍＢ脂质体制剂。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药
，是抗真菌药两性霉素B的一种纳米制剂。
技术介绍
两性霉素B(AmB)属大环多烯类抗生素，是用于治疗深部真菌感染的首选药物。隐球菌性脑膜炎是一种常见的深部真菌感染性疾病，用AmB治疗的最大问题是由于其不易透过血脑屏障，鞘内直接注射给药不仅操作不便，而且由于危险性高，合并症较多，患者难以接受。临床应用的脂质体制剂虽经证明能够穿越血脑屏障，但因价格昂贵、实际疗效并不确切而限制了广泛使用。
技术实现思路
本专利技术以聚氰基丙烯酸正丁酯(PBCA)为AmB载体材料，提供一种能通过血脑屏障的AmB纳米制剂。制备方法如下一、试剂1、两性霉素B(25mg/支、上海新先锋药业)；2、α-氰基丙烯酸正丁酯(北京瞬康医用胶有限公司)；3、右旋糖苷Dextran T-70(Pharmacia公司)；4、Polxamer 188(北京世纪华林生物科技有限公司)；5、聚山梨酯-80(Tween-80)(上海化学试剂公司)；二、具体制备方法将稳定剂Dextran-70和/或Poloxamer188各按6mg/ml的浓度溶于蒸馏水，同时加或不加助溶剂脱氧胆酸钠，浓度为0.4mg/ml，在pH值约为3的条件下边搅拌边缓缓加入α-氰基丙烯酸正丁酯，至终浓度为1％，搅拌约4小时后，调pH值至7.5-8.5，得空白α-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，然后以空白纳米粒胶体溶液10ml:20mg两性霉素B粉剂的比例加入两性霉素B粉剂，在pH值约为7的中性条件下继续搅拌约4小时，得两性霉素B-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(AmB-PBCA-NP)胶体溶液，最后用1％的聚山梨酯-80于37℃恒温箱中孵化，即成两性霉素B纳米制剂。激光粒度分析仪测定粒径大小及分布取上述两性霉素B纳米制剂适量，加注射用水使分散，置Nano-S粒径测定仪中测定粒径，平均粒径为74.38nm。透射电镜下观察纳米粒形态本专利技术两性霉素B纳米制剂外观呈淡黄色不透明乳状液体，取1-2滴溶液置于铜网上，2％磷钨酸溶液负染色，室温晾干，透射电镜下观察其形态，纳米粒呈圆或类圆形，大小较为均匀，无明显聚集。紫外法测定包封率和载药量取两性霉素B纳米制剂适量，于4℃、35000r/min离心，取上清液测定紫外吸收度，所得浓度计为Cb(mg/ml)，按投药量计算AmB的初始浓度，计为C(mg/ml)，PBCA-NP空白纳米粒的初始浓度计为M(mg/ml)，按以下公式计算包封率及载药量。包封率计算公式E=C-CbC×100%]]>载药量计算公式为Y(mg/mg)=C-CbM×100%]]>得包封率范围在23.10％-56.10％，载药量为25％-92％。两性霉素B纳米制剂的体外释放试验选择聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的水溶液为保护胶体，配制较高浓度的PVP水溶液，加入适量置AmB-PBCA-NP液中，制成含PVP为2％的AmB-PBCA-NP液，超声振荡5分钟，室温振摇12小时。取1ml置于已处理好的透析袋中，进行体外释放实验，结果表明，本专利技术制剂呈时间依赖性释放，5小时释放40.9％，10小时释放47.45％，24小时释放93.28％，具有一定缓释性。具体实施例方式现结合实施例，对本专利技术作详细描述实施例1称取300mg Dextran-70，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.5，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本专利技术纳米制剂。经检测，包封率56.10％，载药量82％，平均粒径为79.9nm。实施例2称取300mg Dextran-70，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至7.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.5，再加入助溶剂脱氧胆酸钠20mg，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本专利技术纳米制剂。经检测，包封率23.1％，载药量25％，平均粒径为90.7nm。实施例3称取300mg Dextran-70和300mgPoloxamer 188，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素粉针剂，测定pH值约为7.0，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本专利技术纳米制剂。经检测，包封率38.4％，载药量92％，平均粒径为83.4nm。实施例4称取300mg Dextran-70和300mgPoloxamer 188，置烧杯中，加蒸馏水搅拌溶解，用0.01mol/L的盐酸调节溶液的pH值至3.0，定容至50ml。于室温、电磁搅拌下缓缓加入0.5ml的BCA，至终浓度为1％，搅拌4小时后，用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH至8.5，得空白PBCA纳米粒胶体溶液。量取空白纳米粒胶体溶液10ml，加入20mg的两性霉素B粉针剂，测定pH值约为7.0，再加入助溶剂脱氧胆酸钠10mg，继续搅拌4小时，得AmB-PBCA-NP胶体溶液。最后加入1％的Tween-80于37℃恒温箱中孵化2小时，即得本专利技术纳米制剂。经检测，包封率34.8％，载药量45％，平均粒径为88.6nm。实施例1中的稳定剂采用Dextran T-70，且不加助溶剂脱氧胆酸钠，结果显示粒径较小，载药量及包封率均较高。动物实验研究为了进一步验证纳米制剂的脑靶向作用，我们进行了动物实验，采用高效液相色谱分析法(HPLC)测定小鼠脑内药物浓度。动物为6-8周龄健康昆明小鼠，雌雄各半，体重25±5g(购于第二军医大学实验动物中心)。动物分成4组，每组21只1、AmB粉针剂组尾静脉注射两性霉素B粉针剂(1mg/kg)2、本专利技术AmB纳米制剂组尾静脉注射AmB-PBCA-NP(3mg/kg)3、AmB脂质体组尾静脉注射AmB-L(10mg/kg)4、空白对照组尾静脉注射生理盐水(注射容积0.1ml)各组小鼠分别于给药后0.5h，1h，3h，6h，12h，24h及48h摘除眼球取血，即刻断髓处死后取脑组织留用。血液置于滴有肝素钠的抗凝管中，轻轻震荡摇匀，防止凝固，离心取上清液100μl备用；脑组织生理盐水作匀浆处理，离心后取上清液100μl，加入含内标的乙腈100μl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种两性霉素Ｂ纳米制剂，制备方法如下：将稳定剂Ｄｅｘｔｒａｎ－７０和／或Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ１８８各按６ｍｇ／ｍｌ的浓度溶于蒸馏水，同时加或不加助溶剂脱氧胆酸钠，浓度为０－０．４ｍｇ／ｍｌ，在ｐＨ值约为３的条件下边搅拌边缓缓加入α－氰 基丙烯酸正丁酯，至浓度为１％，搅拌约４小时后，调ｐＨ值至７．５－８．５，得空白α－聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，然后以空白纳米粒胶体溶液１０ｍｌ∶２０ｍｇ两性霉素Ｂ粉剂的比例加入两性霉素Ｂ粉剂，在ｐＨ值约为７的中性条件下继续搅拌约４小时，得两性霉素Ｂ－聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，最后用１％的聚山梨酯－８０于３７℃恒温箱中孵化，即成两性霉素Ｂ纳米制剂。

【技术特征摘要】
1.一种两性霉素B纳米制剂，制备方法如下将稳定剂Dextran-70和/或Poloxamer188各按6mg/ml的浓度溶于蒸馏水，同时加或不加助溶剂脱氧胆酸钠，浓度为0-0.4mg/ml，在pH值约为3的条件下边搅拌边缓缓加入α-氰基丙烯酸正丁酯，至浓度为1％，搅拌约4小时后，调pH值至7.5-8.5，得空白α-聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒胶体溶液，然后以空白纳米粒胶体溶液10ml∶20m...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈江汉，温海，徐楠，汪晓军，徐赤宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]