冻干水痘疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种冻干水痘疫苗的制备方法，属于生物技术领域。包括水痘病毒Ｏｋａ株在ＭＲＣ－５株人二倍体细胞中的扩增传代、疫苗液收获及冻干，其特征在于采用如下冻干保护剂，终浓度为：明胶：０．５－１．２％（ｇ／ｍｌ）；谷氨酸钠：０．６－１．２％（ｇ／ｍｌ）；尿素：０．３－０．９％（ｇ／ｍｌ）；精氨酸：０．０５－０．２％（ｇ／ｍｌ）。优点在于：冻干保护剂采用自行研制的疫苗冻干保护溶液，确保疫苗稳定性良好，２～８℃保存稳定性试验结果显示：保存１８个月的样品与０月样品各项检测结果没有显著差别。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗生产制备工艺
，具体涉及一种水痘疫苗的制备方法。
技术介绍
水痘-带状疱疹病毒(VZV)是水痘和带状疱疹的病原体。水痘为该病毒原发感染的表现，主要侵染儿童，以皮肤和粘膜上出现疱疹为特征，本病症状较轻，但传染性很强，几乎对20岁以下的绝大多数人感染，患病后终生免疫，一般不再发生第二次感染；带状疱疹则是一种散发疾病，为具有部分免疫的人由潜伏在脊髓后根神经节或脑神经感觉神经节的神经细胞内的潜伏水痘-带状疱疹病毒被激活后引起，患者主要为成年人，特别是那些正在接受免疫抑制剂治疗的癌症患者和老年人，其特征为脊髓神经后根及神经节发炎，由此神经支配的皮肤上出现疱疹，有疼痛或神经痛。水痘和带状疱疹均可伴有严重的并发症。VZV属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科家族的成员。人是VZV的唯一宿主。体外分离培养VZV以人二倍体成纤维细胞(原代人胚肺纤维细胞、WI-38、MRC-5细胞)为佳。进行病毒传代时，通常以接种感染细胞为主。VZV在体外极不稳定。1974年，日本大阪大学微生物疾病研究所(BIKEN)的M.Takahashi先生建立了VZV Oka疫苗株。1981年，美国学者报道了KMcC株候选水痘疫苗。1994年，中国报道了北京株候选水痘疫苗的研制。目前在世界各地广泛使用的水痘疫苗均为Oka株疫苗。临床研究证明，Oka株水痘疫苗接种反应轻微，能诱导机体产生良好的、持久的免疫应答和保护效果。目前，使用水痘减毒活疫苗进行普遍的儿童免疫接种已成为世界各国降低乃至切断水痘流行的重要手段及趋势。
技术实现思路
本专利技术提供了一种冻干水痘疫苗的制备方法，以解决目前疫苗稳定性差的问题。本专利技术采取的技术方案是包括水痘病毒Oka株在MRC-5株人二倍体细胞中的扩增传代、疫苗液收获及冻干，其特征在于采用如下冻干保护剂，终浓度为明胶0.5-1.2％(g/ml)；谷氨酸钠0.6-1.2％(g/ml)；尿素0.3-0.9％(g/ml)；精氨酸0.05-0.2％(g/ml)。本专利技术一种实施方式是取人二倍体细胞MRC-5按1∶2-1∶4比例，以pH7.2-7.6、添加10-15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基，37℃下，培养3-5天扩增传代，33代以内；待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.2-7.6、含2-5％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶60-120加入水痘病毒Oka株感染细胞；当MRC-5细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液二倍体积以上的Earle’s液或PBS缓冲液洗涤细胞表面，洗去牛血清；加入含有0.3-2％人血白蛋白、3-10％蔗糖的199综合培养基或PBS缓冲液疫苗液，收获细胞培养物；将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、过滤收集上清液，即为原液；原液内加入终浓度为明胶0.5-1.2％(g/ml)、谷氨酸钠0.6-1.2％(g/ml)、尿素0.3-0.9％(g/ml)、精氨酸0.05-0.2％(g/ml)的冻干保护剂制成半成品，检定合格的半成品冰浴下将分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干；检定合格即为冻干水痘疫苗成品。本专利技术的优点在于冻干保护剂采用自行研制的疫苗冻干保护溶液，确保疫苗稳定性良好，2～8℃保存稳定性试验结果显示保存18个月的样品与0月样品各项检测结果没有显著差别。具体实施例方式实施例1取人二倍体细胞MRC-5按1∶2比例，以pH7.2、添加10％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基，37℃下，培养3天扩增传代，33代以内；待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.2、含2％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶60加入水痘病毒Oka株感染细胞；当MRC-5细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用相当于原维持液二倍体积以上的Earle’s液液洗涤细胞表面，洗去牛血清；加入含有0.3％人血白蛋白、10％蔗糖的199综合培养基疫苗液，收获细胞培养物；将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为原液；原液内加入终浓度为0.5％明胶、1.2％谷氨酸钠、0.9％尿素、0.05％精氨酸的冻干保护剂制成半成品，检定合格的半成品冰浴下将分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。实施例2取人二倍体细胞MRC-5按1∶4比例，以pH7.6、添加12％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基，37℃下，培养5天扩增传代，33代以内；待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.4、含5％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶100加入水痘病毒Oka株感染细胞；当MRC-5细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用相当于原维持液2倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞表面，洗去牛血清；加入含有2％人血白蛋白、3％蔗糖的PBS缓冲液疫苗液，收获细胞培养物；将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、经澄清过滤后，即为原液；原液内加入终浓度为1.2％明胶、0.9％谷氨酸钠、0.6％尿素、0.1％精氨酸的冻干保护剂制成半成品，检定合格的半成品冰浴下将分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。实施例3取人二倍体细胞MRC-5按1∶3比例，以pH7.4、添加15％小牛血清的MEM细胞培养基为细胞传代用培养基，37℃下，培养4天扩增传代，33代以内；待MRC-5细胞形成均匀、致密的细胞单层后，更换pH7.6、含3.5％小牛血清的MEM培养基维持液，在培养瓶内按毒种与细胞接种比例1∶120加入水痘病毒Oka株感染细胞；当MRC-5细胞上出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用原维持液3倍体积的Earle’s液洗涤细胞表面，洗去牛血清；加入含有1％人血白蛋白、8％蔗糖的199综合培养基疫苗液，收获细胞培养物；将细胞培养物经-70℃以下冻融、20KHz超声破碎细胞、过滤收集上清液，即为原液；原液内加入终浓度为0.8％明胶、0.6％谷氨酸钠、0.3％尿素、0.2％精氨酸的冻干保护剂制成半成品，检定合格的半成品冰浴下将分装于适宜的可药用容器内，以适宜的冻干方式进行冻干。实施例4按实施例1-3生产的冻干水痘疫苗的各项检定结果如下表 实施例5，冻干水痘疫苗的稳定性考察结果表1 加速稳定性试验结果 表2 2～8℃保存效期内稳定性试验结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种冻干水痘疫苗的制备方法，包括水痘病毒Ｏｋａ株在ＭＲＣ－５株人二倍体细胞中的扩增传代、疫苗液收获及冻干，其特征在于采用如下冻干保护剂，终浓度为：明胶：０．５－１．２％（ｇ／ｍｌ）；谷氨酸钠：０．６－１．２％（ｇ／ｍｌ）；尿素：０．３－０．９％（ｇ／ｍｌ）；精氨酸：０．０５－０．２％（ｇ／ｍｌ）。

【技术特征摘要】
1.一种冻干水痘疫苗的制备方法，包括水痘病毒Oka株在MRC-5株人二倍体细胞中的扩增传代、疫苗液收获及冻干，其特征在于采用如下冻干保护剂，终浓度为明胶0.5-1.2％(g/ml)；谷氨酸钠0.6-1.2％(g/ml)；尿素0.3-0.9％(g/ml)；精氨酸0.05-0.2％(g/ml)。2.权利要求1所述的冻干水痘疫苗的制备方法，包括下列步骤1)以水痘病毒Oka株为毒种，MRC-5株人二倍体细胞为培养基质；2)用培养基对MRC-5株人二倍体细胞进行扩增传代，其中细胞传代比例为1∶2-1∶4，以37℃培养3～5天；3)待MRC-5株人二倍体细胞生长成均匀、致密的单层细胞后，加入毒种感染细胞；4)当MRC-5株人二倍体细胞出现75％以上典型病变时，倒去原维持液，用相当于维持液...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱昌林，魏巍，孙会来，孔维，王忠诚，郭丽姝，万铁军，曾智，姜春来，
申请(专利权)人：长春百克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]