纯化DNAK的方法技术

重组的纯化ＤｎａＫ，其具有ＡＴＰ酶活性而不加入其它的伴侣蛋白，并且其实质上不含Ｔ－细胞刺激性杂质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化DNAK的方法
本专利技术涉及纯化热激蛋白(Heat Shock Protein)的方法。在应激状态下，所有的细胞热激蛋白(HSP)的表达可上调。热激 蛋白是分子伴侣并参与蛋白折叠。HSP分为大约6个家族并在进化中高度保守。HSP和肽之间形成的复合体在抗原呈递中扮演重要角色。HSP也 参与形成一些自身免疫性疾病。可参见van Eden等人的综述(Nature Reviews. Immunology 5 (2005) 318-330)。DnaK是细菌的HSP 70家族成员。纯化DnaK的方法是已知的， 但是制品的纯度存在问题。通常，如果在SDS-PAGE上只检测到唯一 一条带，则认为DnaK制品是纯的。但是，这样的制品不是非常纯的。Sch6nfeld等人J. Biol. Chem. 270 (1995) 2183 -2189中描述了 SDS-PAGE纯的DnaK其凝胶过滤分析表明却有至少三个峰。纯化HSP的方法是已知的，参见例如-Nandan et al. J., Immunological Methods (1994) 176: 255-264, -Grossmann et al" Exp. cell Res. (2004) 297: 108-117, -Peng et al" J. Immunological Methods (1997) 204: 13-21禾口 -Jindal et al.， Biotechnology (1995) 13: 1105-1109。 关于HSP特别是DnaK的免疫特性，过去曾经报道了不一致的数 据。DnaK增强抗原呈递细胞上抗原经I类或II类主要组织相容性复合 体(MHC)的处理(Tobian et al.， J. Immunological 172 (2004), 5277-5286;Tobian, Canaday, Harding J. Immunol. 173 (2004) 5130-5137)。根据其来 源、剂量和施用途径的不同，天然的DnaK可表现出不同的甚至是相 反的免疫交女应类型(van Eden, van der Zee禾口 Prakken Nat Rev. Immunol. 5 (2005): 318-330)。己经在慢性炎性疾病，例如类风湿关节炎、I型糖 尿病和动脉硬化症中观察到抗自体同源HSP的自身免疫反应。怀疑细 菌HSP和自体同源HSP之间的抗原交叉反应是引起自身免疫性形成的原因。另一方面，在I型糖尿病和类风湿关节炎的临床试验中，HSP 也表现出促进T细胞从促炎性细胞因子分泌谱向促调节性细胞因子分泌谱转变，这表明其炎性疾病的免疫调节(Bloemendaletal.,Clin.Exp. Immunol. 110 (1997): 72-78)。更近期，Galdiero等人报道，DnaK不诱 导淋巴细胞和巨噬细胞上共刺激分子(CD80/CD86)表达增加(Galdiero et al" Int. J. Imm腦pathol. Pharmacol. 18 (2005) 637-644)。据信，这些不一致性是基于纯化方法不同，从而产生了与各种杂 质和污染物相结合的DnaK。此外，由于DnaK是ATP酶，它与腺嘌呤 核苷酸结合。不同形式的DnaK共同存在且可被纯化带有ATP的 DnaK、带有ADP的DnaK和不含核苷酸的DnaK。这些不同形式的 DnaK可具有不同的免疫效应。本专利技术的目标是提供一种纯化DnaK的方法，该方法至少克服了 现有技术的一些缺点，特别是提供纯度增加的DnaK。在一个方面，问题的解决是通过重组纯化热激蛋白HSP，优选 DnaK:-具有ATP酶活性而不加入其它的伴侣蛋白 -实质上不含T-细胞刺激性杂质。纯化的重组热激蛋白的特征是其具有ATP酶活性而不加入其它的 伴侣蛋白。在实施例中描述了用于测试ATP酶活性的合适的方法。而且，制品不含T-细胞刺激性杂质。这要求内毒素含量非常低。 制品在TH-1 (产生干扰素-Y)和TH-2 (产生IL-5或IL-13)上不表现 出效应。在实施例中对此进行了进一步描述。制品优选为不含免疫刺激性杂质，包括T-细胞刺激性杂质。 "实质上不含免疫刺激性杂质"意思是-直至30 |ig/ml未观察到T-细胞增殖；-直至10 pg/ml未观察到TNF-a产生。本专利技术进一步目标是一种DnaK，其具有a) 纯度为按重量计95%或更高；b) 残余DNA污染物《lng/mg蛋白；c) 残余宿主细胞蛋白污染物(HCP) <5% (按重量计)；d) 内毒素污染物〈0.5E.U./吗蛋白。计算纯化DnaK的纯度是基于"每…重量蛋白中"，即所有蛋白中 至少95%为DnaK。优选的，含量为至少97%，更优选的为至少98% (按蛋白重量计)。优选地，这个数值是通过SDS-PAGE凝胶，然后进行考马斯染色 和密度计量学的分析来确定。DNA的含量优选非常低，即《lng/mg蛋白，优选为《0.5 ng/mg 蛋白。DNA污染物通过RT-PCR使用特异性引物来测定。测试条件取决于表达系统的类型。例如，对于在大肠杆菌(Eco/O 中的表达，23S DNA的特异性引物是合适的。对于在巴斯德毕赤酵母 (P/xwtewr/s)中的表达，在18S DNA中选择合适的引物。这些方法对本领域技术人员来说是已知的。此外，残余宿主细胞蛋白污染物按重量计<5%，优选为按重量计 <1%,更优选为按重量计《0.0001%。优选地，这通过ELISA测试来 确定，可由美国Cygnus Technologies Inc.商售的用于测定￡.co//细胞蛋 白的产品"Kit ￡.co//host cell proteins"获得。必须选择表达系统相应 的测试系统，即Cygnus Technologies Inc.也已经开发出其它表达系统相 应的ELISA。例如SDS-PAGE (带银染)、HPLC或Western Blotting作 为其它的替代方法是合适的。根据LAL动力学测试(可由美国Cambrex Corporation商售的产品 "Kinetic-QCL⑧获得)所示，内毒素污染物为<0.5 E.U./昭蛋白。优选 的含量为<0.1 E.U./吗蛋白，和优选的<0.01 E.U,/昭蛋白。现在已经理解，DnaK可以含有免疫刺激性杂质污染物，特别是.--蛋白；-肽；-核酸；-脂多糖(LPS)。DnaK是伴侣蛋白，且因此与其它蛋白和肽结合。 现有技术的纯化方法显然不能除去DnaK制品中结合的和未结合的杂质。令人惊奇的是，本专利技术的纯化步骤可能获得高纯度的重组DimK，特别是不含免疫刺激性杂质。对于DnaK在药物制品上的应用，特别是作为佐剂，DnaK不含免疫刺激性杂质是绝对必要的。本专利技术的另一个方面是从细胞裂解液中纯化重组热激蛋白(优选DnaK)的方法，所述方法包含下列步骤a) 离子交换色谱；b) 羟磷灰石色谱；a)明胶色谱。在本专利技术的一个优选方面，DnaK来自腐生细菌，如大肠杆菌或致 病菌，如结核分支杆菌(A^co6acfer/ww加6ercw/cw/s)。在优选具体实施方式中，离子交换色谱是阴离子交换色谱。对于羟磷本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组纯化的ＤｎａＫ制品，其：　－具有ＡＴＰ酶活性而不加入任何其它的伴侣蛋白；　－实质上不含Ｔ－细胞刺激性杂质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：F黑诺特，T莱岗，S皮若通，G普拉西尔，
申请(专利权)人：生物技术工具公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]