逆转双向洗脱ｐＨ－区带精制逆流色谱法分离生物碱的方法技术

本发明专利技术涉及天然药物领域，具体涉及一种逆转双向洗脱ｐＨ－区带精制逆流色谱法分离纯化生物碱的方法。其特征是该方法包括：将总生物碱溶于固定相和流动相的混合液中，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，本发明专利技术在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗脱出柱子时，交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。本发明专利技术在同等硬件设备基础上提高分离效果，显著提高所得化合物的纯度，操作方便，一次分离即可得到高纯度产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及天然药物领域，具体涉及生物碱分离纯化
，即利用逆转双向 洗脱PH-区带精制逆流色谱法分离纯化方法从中草药中分离纯化高纯度的单体生物碱的 方法。
技术介绍
生物碱在植物体内含量少，但具有较强的生理活性。许多生物碱是治病良药，如毛 茛科黄连根茎中的小檗碱是黄连素的主要成分，有抗菌消炎作用；萝芙木中的利血平能降 血压；石蒜中的加兰他敏对小儿麻痹后遗症有疗效，罂粟果皮中所含的吗啡碱是著名镇痛 剂；奎宁碱是有价值的解热药；三尖杉碱和长春花碱是治癌良药；秋水仙素(碱)能人工诱 变产生多倍体。有的生物碱可用来制作农业用的杀虫剂。生物碱类化合物在化学，生物学 都有广泛的运用，极具商业价值。由于这各种生物碱的碱性不同，给分离纯化工作带来了很 多困难，在传统色谱分离中不可逆吸附，峰展宽，峰拖尾等现象很难避免。因此如何快速、高 效地从生药材粗提物中分离并纯化得到单体生物碱是大家比较关心的课题。pH-区带精制逆流色谱是作为一种改进的高速逆流技术按照液液分配色谱技术的 原理，不用任何固体支撑体或载体，因此克服了传统分离方法对样品的不可逆性吸附作用， 理论回收率为100 %。该方法分离可离子化的PKa值相差大于0. 2的物质，具有一系列优 点①与普通的高速逆流色谱相比，进样量提高了 10倍。②流分被高度浓缩。③样品量的 增加，是纯流分的产率明显增加。④少量的杂质被高度浓缩在主峰的边缘而易于检测。⑤ 没有紫外吸收的样品可以通过测定流出液的PH值而实现在线监测。(高速逆流色谱分离技 术及应用，曹雪丽编著，化学工业出版社)尽管具有上述优点，但产品的纯度还不够高，有待进一步改进。
技术实现思路
本专利技术公开了一种逆转双向洗脱的pH-区带精制逆流色谱法分离提纯生物碱的 方法，该技术具有高效，快速，可在不改变硬件的条件下显著改善分离效果，产品纯度大于 98%。准备总生物碱溶液，将总生物碱溶于固定相和流动相的混合液中，使逆流色谱仪 柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，收集流分即得，这是 普通的PH-区带精制逆流色谱技术，本专利技术在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗 脱出柱子时，交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。所谓交 换流动相和固定相是前面作为流动相的溶剂在后面的操作中作为固定相，同样地，前面作 为固定相的溶剂在后面的操作中作为流动相。更为优选的方法包括配制两相溶剂将水和选自正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙 酸乙酯、正丁醇、甲醇中的两 三个溶剂混合，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为 固定相，将总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改为将下相 以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5分钟或 根据流分的PH变化在色谱柱的首端接收目标成分。上述方法中的流动相和固定相可以根据不同的生物碱选取，参考文献即可，例如 乙酸乙酯正丁醇水的混合溶剂。不同植物的总生物碱可以从市场购得，也可参考文献 得到。与pH-区带精制逆流色谱技术相同，本专利技术的方法也适合从总生物碱中分离可离 子化的PKa值相差大于0. 2的物质。本专利技术还公开了一种从洋金花总生物碱中分离纯化东莨菪碱和阿托品的方法，即 采用逆转双向洗脱的PH-区带精制逆流色谱法分离，包括配制两相溶剂乙酸乙酯正丁 醇水体积比=3.8-4.2 0.8-1.2 4. 8-5. 2，上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸 为固定相，将洋金花总生物碱溶于两相混合溶剂中，用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转 动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相，200-250分钟后，停止泵入上相，改 为将下相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主机转动方向调整为逆时针转动，每3-5 分钟或根据流分的PH变化在色谱柱的首端接收目标成分。目标物东莨菪碱和阿托品，它们 的纯度都大于99%。其中主机转速优选800-900rpm。其中泵入流速优选0. 8-1. 5mL/min。三乙胺加入A相后的浓度优选1.6^-0.50%,盐酸加入B相后的浓度为 0. 80% -0. 15%。均为体积百分比。而普通的pH-区带精制逆流色谱技术得到的产品纯度达不到要求，方法如下将 洋金花总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含三乙胺的上相溶剂的混合液中制 成样品溶液。使逆流色谱仪柱子中充满固定相，顺时针转动主机，由进样阀进样，再将流动 相从逆流色谱柱的首端泵入柱内，进行分离，每3-5分钟或根据流分的pH变化在色谱柱 的尾端接收目标成分。所分离得到的阿托品和东莨菪碱的纯度只能分别达到96. 91%和 86. 32%，并不能满足需求。所用的溶剂和浓度均与上述逆转双向洗脱pH-区带精制逆流色 谱法中相同。洋金花总生物碱的制备方法可参考文献，也可用下列方法制备将干燥的洋金花 粉碎后以70% -100%的乙醇水或甲醇水溶液加热回流提取，将滤液减压浓缩成浸膏。然 后用酸水溶解后以二氯甲烷萃取除脂溶性杂质，再碱化后以二氯甲烷萃取得洋金花总生物 碱。本专利技术的制备方法优点在于在同等硬件设备基础上提高分离效果，显著提高所 得化合物的纯度，操作方便，一次分离即可得到高纯度产品。另外，黄连药材中除小檗碱和巴马亭外的其他五种主要生物碱由于含量较少，分 离难度大，本专利技术又公开了采用逆转双向洗脱的PH-区带精制逆流色谱法从黄连总生物碱 中一次性分离纯化黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱和木兰碱的方法，包括配制两相 溶剂正己烷乙酸乙酯甲醇水体积比=0.8-1. 2 4.8-5.2 0.8-1.2 4.8-5.2， 上相加入三乙胺为流动相，下相加入盐酸为固定相，将黄连总生物碱溶于两相混合溶剂中， 用下相溶剂填充逆流色谱柱，顺时针转动主机，通过进样阀进样，从逆流色谱柱首端泵入上相以同流速从尾端泵入逆流色谱柱，同时将主 机转动方向调整为逆时针转动，根据流分的紫外吸收或PH变化在色谱柱的首端接收目标 成分。目标物黄连碱，药根碱，非洲防己碱，表小檗碱，木兰碱，它们的纯度都大于98%。其中主机转速优选800_900rpm。其中泵入流速优选0. 8-1. 5mL/min。三乙胺加入A相后的浓度优选1.6% -0.50%，盐酸加入B相后的浓度优选 0. 80% -0. 15%。均为体积百分比。而采用普通的pH-区带精制逆流色谱技术则产品纯度达不到要求，方法如下将 黄连总生物碱溶于8mL含HCl的下相溶剂和2mL不含三乙胺的上相溶剂的混合液中制成样 品溶液。使逆流色谱仪柱子中充满固定相，顺时针转动主机，由进样阀进样，再将流动相从 逆流色谱柱的首端泵入柱内，进行分离，根据流分的紫外吸收或PH变化在色谱柱的尾端接 收目标成分。对上述几种生物碱不能达到有效分离。所用的溶剂和浓度均与上述逆转双向 洗脱PH-区带精制逆流色谱法中相同。黄连总生物碱的制备方法可参考文献，也可用下列方法制备将干燥的黄连粉碎 后以70% -100%的乙醇水或甲醇水溶液加热回流提取，将滤液减压浓缩成浸膏。然后用酸 水溶解，过滤，沉淀为小檗碱和巴马亭部位，滤液以二氯甲烷萃取除脂溶性杂质，再碱化后 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用逆转双向的ｐＨ－区带精制逆流色谱法从总生物碱中分离纯化生物碱的方法，包括：配制流动相和固定相，将总生物碱溶于流动相和固定相的混合溶剂中，使逆流色谱仪柱子中充满固定相，由进样阀进样，再将流动相泵入柱子中，进行分离，其特征是：在完成上述过程后，当目标成分尚未流出被洗脱出柱子时交换流动相和固定相，并改变逆流色谱仪的转动方向，收集流分，即得。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令义，何雨桐，罗建光，杨新苗，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]