生物大分子浓缩除盐方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的方法和试剂盒，所述生物大分子为蛋白质或者核酸，本发明专利技术的方法包括：配置聚丙烯酰胺凝胶并烘干，然后放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀，收集留在凝胶外部的生物大分子。本发明专利技术提供的聚丙烯酰胺凝胶浓缩除盐方法和试剂盒能有效地处理液体样本，操作流程简易，并使蛋白质、核酸等生物大分子不变性、损失小，不仅浓缩和除盐效率高，所用聚丙烯酰胺凝胶还能回收、反复利用，是现有的液体蛋白质、核酸样品制备，样本浓缩和除盐方法的很好的替代品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学
，特别是涉及一种对液体样本中的生物大分子进 行浓缩除盐的方法以及采用该方法的试剂盒。
技术介绍
膀胱癌是一种严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤，占全球癌症发病率的2. 3%。 在我国泌尿系统恶性肿瘤中，膀胱癌发病率和死亡率均占首位，复发率高达50 % -70 %，远 端转移占10% -20%。这种高死亡率在很大程度上是由于膀胱癌的检测技术不够灵敏所 致。目前，膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜检查，一般是在患者出现血尿后才引起注意；但是 在这种症状下，膀胱癌已发展至中晚期，伴随严重的并发症，很难找到有效的治疗手段，而 且也无法避免高复发率。因此，膀胱癌的早期诊断具有极其重要的临床应用价值，能够极大 地提高膀胱癌的早期诊断水平和明显地改善膀胱癌患者的生活质量。类似膀胱癌这种疾病的诊断是通过尿液的致癌标志物来检测。尿液或其它体液具 有样本体积很大、蛋白质浓度比较低的特点，如何富集蛋白质已成为尿液等体液的相关研 究和临床中必须面临与要解决的问题。现在用于蛋白质制备，样品浓缩、除盐的方法有超滤法、透析法、丙酮沉淀等方法。 相对来说，超滤法成本较高，且滤膜上会吸附部分蛋白质会造成蛋白损失，特别对于低分子 量和低丰度蛋白来说特别明显，超滤管一般用了 1次就不建议重复使用；透析法时间特别 长，虽然能除盐，但是不能富集蛋白；丙酮沉淀制备蛋白的方法具有使蛋白质变性的副作 用，并且不利于处理大体积的样本，回收率也不高。如何找到一种成本低，浓缩、除盐效率 高，使样品保持活性，化学试剂污染小，能回收的方法或试剂处理大体积液体样本将会给相 关研究与临床带来新的突破口。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种适合用于大体积液体样本、浓缩 或除盐效率高且不会造成生物大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐 的方法。本专利技术的另一目的在于提供一种适合用于大体积液体样本、浓缩和除盐效率高且 不会造成生物大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案本专利技术公开了一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的方法，所述方法 包括a、根据待浓缩或除盐的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝胶，b、将凝固后的聚丙烯酰胺凝胶烘干；C、将烘干后的聚丙烯酰胺凝胶放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀；d、收集留在凝胶外部的生物大分子。优选的，步骤b中，聚丙烯酰胺凝胶的烘干温度为50 70°C。所述生物大分子为蛋白质或者核酸。优选的，所述液体样本为尿液，所述生物大分 子为尿液蛋白。所述步骤a中配置聚丙烯酰胺凝胶的浓度优选为10 15%，更优选13%。步骤c中，液体样本体积不超过烘干前聚丙烯酰胺凝胶体积的60%。且优选将步 骤c置于4°C _15°C更优选于4°C下进行。在本专利技术具体 的实施方式中，步骤d中，所述收集留在凝胶外部的生物大分子的 具体过程包括，用水或缓冲液冲洗凝胶外部，使留在凝胶外部的生物大分子溶解，然后将凝 胶转入提前置于收集管中的网状疏水性提篮，将提篮上提一定高度保证提篮中的凝胶高于 收集管内的液面，并与收集管固定后，于50 150g离心2 5min，收集冲洗及离心后的液 体，得到浓缩除盐后的生物大分子。优选的，所述方法在步骤d后进一步包括，将聚丙烯酰胺凝胶充分清洗干净后回 收使用，所述聚丙烯酰胺凝胶充分清洗干净的方法包括纯水充分浸泡或超声洗涤。本专利技术进一步公开了一种用于对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的试剂 盒，所述生物大分子为蛋白质或者核酸，所述试剂盒含有能够配置得到聚丙烯酰胺凝胶的 配方成分，或者所述试剂盒含有于50 70°C进行烘干的聚丙烯酰胺干凝胶。优选的，所述液体样本为尿液，所述生物大分子为尿液蛋白，所述配置得到聚丙烯 酰胺凝胶的浓度为10 15%，优选13%，或者所述聚丙烯酰胺干凝胶在烘干前的浓度为 10 15%，优选 13%。由于采用了以上技术方案，使本专利技术具备的有益效果在于本专利技术提供的聚丙烯酰胺凝胶浓缩除盐方法和试剂盒能有效地处理液体样本，操 作流程简易，并使蛋白质、核酸等生物大分子不变性、损失小，不仅浓缩和除盐效率高，所用 聚丙烯酰胺凝胶还能回收、反复利用，化学试剂残余几乎为0，方便后期实验的处理，是现有 的液体蛋白质、核酸样品制备、样本浓缩和除盐方法的很好的替代品。特别低，本专利技术采用 温和烘干的方式(于50 70°C优选65°C充分烘干使脱水完全)制备干凝胶，不会改变凝 胶分子的亲水性及交联度，属自然无变性过程，烘干后吸胀速度快；避免了利用醇类或酮类 物质进行脱水会造成凝胶分子亲水性和交联度的改变，使凝胶孔径变大，蛋白质等大分子 物质容易进入胶内而造成损失，且吸胀速度慢的缺点。本专利技术制备干凝胶的方法操作简单 且无其他化学物质(如醇类和酮类)的残留，避免对蛋白质等样品的污染或变性和修饰等 不良影响。胶浓缩效率高，成本低(浓度为13%的聚丙烯酰胺凝胶即可浓缩得到分子量大 于IOKD的蛋白质)。附图说明图1为本专利技术一种聚丙烯酰胺凝胶法制备浓缩、除盐样品的操作流程图；图2为本专利技术实施例5的4个尿液样本用不同方法处理后跑SDS胶的结果图。具体实施例方式本专利技术公开了一种适合用于大体积液体样本、浓缩和除盐效率高且不会造成生物 大分子变性的对液体样本中的生物大分子进行浓缩除盐的方法和试剂盒。下面的实施例仅 用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。本专利技术是采用将一定浓度的聚丙烯酰胺凝胶用温和烘干(50-70°C优选65°C )等 方式脱水完全至变硬后加入适当体积的液体样品，置于4°C -15°C优选4°C待凝胶自然吸胀 完全后，水分和一些盐类等小分子会被吸进胶内，而大分子的蛋白质、核酸则被截留在胶表 面，再用适当体积的溶剂将蛋白或核酸冲洗并溶解，快速转入新管。这样便得到浓缩和除盐 后的样品。在本专利技术具体的实施方式中，本专利技术的目的可以通过以下操作流程来实现1)按下表所列的对应关系，根据提取或浓缩或除盐生物大分子的最低分子量选择 配置合适的聚丙烯酰胺凝胶的浓度。表1截留分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围/Pa I 凝胶浓度/(%)— 蛋白质_>5k__20_>10k__\3_>20k__8_>30k__5_>50k3核酸_>lk__20__>5k__12_>10k__8_>20k__5_>50k__2_在本专利技术中，配置聚丙烯酰胺凝胶的配方采用本领域常规使用的配方，通 常包括单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)、交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(N， N-methylene-bisacylamide,简称 Bis)、加速剂 N，N, N, N-四甲基乙二胺(简称 TEMED)和 催化剂过硫酸铵(简称APS)或核黄素。2)待配置好的聚丙烯酰胺凝胶凝固后，将凝固后的凝胶于50 70°C优选65°C充 分烘干使脱水完全。65°C为常用烘干温度，波动范围50°C -70°C为宜，温度过低所需烘干时 间长，温度过高容易破坏分子结构，包括聚丙烯酰胺凝胶结构。3)将上述烘干脱水完全的干凝胶放置于液体样品内，于4°C -15°C (常用温度为 4°C，为冰箱常用温度之一)条件下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对液体样本中的生物大分子进行浓缩或除盐的方法，所述方法包括：ａ、根据待浓缩或除盐的生物大分子的分子量配置聚丙烯酰胺凝胶，ｂ、将凝固后的聚丙烯酰胺凝胶烘干；ｃ、将烘干后的聚丙烯酰胺凝胶放置于液体样本中使干凝胶充分吸胀；ｄ、收集留在凝胶外部的生物大分子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林志龙，邱雪梅，林梁，李启沅，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94