一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法技术

本发明专利技术公开一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附醋酸泼尼松衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用醋酸泼尼松衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线Ｔ线，和用羊抗鼠ＩｇＧ溶液包被直线式对照线Ｃ线，两条线竖向平行排列。其具体步骤：制备人工结合抗原；制备醋酸泼尼松衍生物的单克隆抗体；制成胶体金溶液；获得抗醋酸泼尼松衍生物单克隆抗体的胶体金标记物和金标结合垫。本发明专利技术具有特异性强，敏感度高，简便、快速、时效性强，结果显示形象、准确的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方 法，属于生物学免疫方法的检测

技术介绍
醋酸泼尼松是一种肾上腺皮质激素类药，具有抗炎、抗过敏、抗风湿、免疫抑制作 用。近几年来，一些不法生产企业为牟取暴利，在未经获得批准的情况下，在治疗免疫性疾 病(例如红斑狼疮、关节炎、肾炎等等)的中药中非法添加醋酸泼尼松等激素，患者在不知情 的情况下，短期内使用这些有问题的“纯中药制剂”，疗效确实不错，但是这些作用其实就是 激素的作用，但是长期使用或是突然停药，问题就出来了 长期使用引起肾上腺抑制，诱发 柯兴氏综合症(满月脸、女性多毛、痤疮、高血压、骨质疏松、性功能紊乱等)；增加感染机会； 影响外伤愈合；增加消化道溃疡出血和穿孔的可能性；生长发育迟缓、精神失调、白内障、 青光眼、骨骼坏死等等。突然停药，导致内源性皮质激素过低(肾上腺萎缩)引起对激素反应 缺乏，病情迅速复发，甚至于恶化。一些急性肾功能不全的病人，突然停止使用激素非常危 险，甚至于致死。如果使用添加了激素的“纯中药制剂”，病人并不知情，而这些病人恰好又 是激素禁忌症和慎用患者，例如活动性消化性溃疡、骨折、高血压、糖尿病、孕妇等，一旦使 用，危险就大了。所以，为了保证人民群众的饮食用药安全，我们必须加大力度打击这种现 象。然而近年来，不法分子非法生产的手段日趋隐蔽，而且由于中药成分比较复杂，检测难 度较大，需要精密的分析仪器和专业技术人员，因而造成监管部门监督抽验成本很大，收效 却不甚理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服以上的不足，提供一种能快速、灵敏、简便地检测醋酸泼 尼松衍生物的醋酸泼尼松胶体金层析检测试纸条及制备方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体 金层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成， 金标结合垫为吸附醋酸泼尼松衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用醋酸泼尼 松衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对 照线C线，两条线竖向平行排列。衬板为不吸水的PCV韧性材料。包被膜为硝酸纤维素膜， 或混合纤维素膜。吸水垫为植物纤维棉纸。醋酸泼尼松衍生物的金标抗体为胶体金标记的 抗醋酸泼尼松衍生物的单克隆抗体复合物，偶联醋酸泼尼松衍生物的载体蛋白为牛血清白 蛋白BSA。一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，制备偶联 醋酸泼尼松衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线；制备偶联醋酸泼 尼松衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备醋酸泼尼松衍生物金标抗体，用于制备吸附醋酸泼尼松衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备 对照线C线，包括如下步骤(A)将醋酸泼尼松衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人 工合成抗原；a、生成水溶性碳化二亚胺(EDC):往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类 原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速称取浓度为60%的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液 无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下 搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4 进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后 进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的 烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止 加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至PH值 为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥， 过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性 碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为半抗原化合物水溶性 碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=1 8-12 :13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤 中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的 溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液(BSA / 0VA)，将载体蛋白与硼酸缓冲液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为 三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液 加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5 °C条件下避光搅拌，待反应完全后，生 成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为 1:15-25 ；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中还装有0. 01-0. 02M磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 5，将透析袋在3_5°C的条件下进行透 析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白 色絮状产品，即为人工合成抗原；(B)将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备醋酸泼尼松衍生物的单克隆抗体细胞 株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白 浓度，备胶体金标记用；(C)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；(D)用0.lmol/LK2C03调节胶体金溶液至最适PH值(8. 5-9. 0)，将适量纯化的单克隆 抗体纯水透析(4hr)后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌(15-30min)，逐滴加入1%络蛋白溶 液，使络浓度为0. 1%，持续搅拌5min，4°C下15000rpm离心lOmin，弃去上清去沉淀物，将沉 淀物用重悬液重新恢复至原体积混勻，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积1/20，4°C保存备用，即获得抗醋酸泼尼松衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，重悬液为含 5%海藻的0. 02Tris-HCL缓冲液；(E)将1:20-1:10稀释的醋酸泼尼松衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡 中，27 °C保温干燥，制备醋酸泼尼松衍生物金标结合垫；(F)在包被膜上用醋酸泼尼松衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检 测线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；(G)试纸条的组装将样品垫、金标组合垫、包被膜和吸水垫依次粘附在衬板上，样品垫 置于衬板的一端，吸水垫置于衬板的另一端，包被膜置于衬板的中间，金标结合垫置于样品 垫和包被膜之间，即得到用于免疫检测的醋酸泼尼松衍生物胶体金层析检测试验纸大板， 将大板按顾客要求分切成本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：由衬板（１）和在衬板（１）上依次衔接的样品垫（２）、金标结合垫（３）、包被膜（４）和吸水垫（５）组成，金标结合垫（３）为吸附醋酸泼尼松衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜（４）上有用醋酸泼尼松衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线Ｔ线（６），和用羊抗鼠ＩｇＧ溶液包被直线式对照线Ｃ线（７），两条线竖向平行排列。

【技术特征摘要】
一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于由衬板(1)和在衬板(1)上依次衔接的样品垫(2)、金标结合垫(3)、包被膜(4)和吸水垫(5)组成，金标结合垫(3)为吸附醋酸泼尼松衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜(4)上有用醋酸泼尼松衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线(6)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线(7)，两条线竖向平行排列。2.根据权利要求1所述一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，其 特征在于所述衬板(1)为不吸水的PCV韧性材料。3.根据权利要求1或2所述一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸 条，其特征在于所述包被膜(4)为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。4.根据权利要求1所述一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，其 特征在于所述吸水垫(5)为植物纤维棉纸。5.根据权利要求1所述一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条，特 征在于醋酸泼尼松衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗醋酸泼尼松衍生物的单克隆抗体 复合物，所述偶联醋酸泼尼松衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。6.一种快速检测醋酸泼尼松及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在 于制备偶联醋酸泼尼松衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线(6); 制备偶联醋酸泼尼松衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备醋酸泼尼松 衍生物金标抗体，用于制备吸附醋酸泼尼松衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠 IgG抗体，用于制备对照线C线(7)，包括如下步骤(A)将醋酸泼尼松衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人 工合成抗原；a、生成水溶性碳化二亚胺(EDC):往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类 原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速称取浓度为60%的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液 无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下 搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4 进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后 进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的 烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止 加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至PH值 为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥， 过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性 碳化...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧卫军，吴迪宏，
申请(专利权)人：南通市伊士生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]