本发明专利技术提供一种核酸分子，所述核酸分子包含：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的核苷酸序列；或（ｂ）与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１互补的核苷酸序列；或（ｃ）与ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１简并的核苷酸序列；或（ｄ）与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１具有至少８５％序列同一性（优选具有至少８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％或９９％序列同一性）的核苷酸序列；或（ｅ）（ａ）～（ｄ）中任一个的一部分，其中所述核酸分子编码一种或多种多肽，或与编码一种或多种多肽的核酸分子互补，或包含在聚酮化合物类分子或巨内酰胺分子的合成中具有活性的一种或多种遗传元件，或与包含在聚酮化合物类分子或巨内酰胺分子的合成中具有活性的一种或多种遗传元件的核酸分子互补。特别是，本发明专利技术涉及编码用于合成聚酮化合物巨内酰胺ＢＥ－１４１０６的生物合成机构的本发明专利技术核酸分子的修饰，包括在微生物中表达经修饰的核酸分子。在某些方面所述修饰包括对编码一种或多种由所述核酸分子编码的活性或蛋白质的序列进行导入、突变、缺失、替换或失活。本发明专利技术的其它方面包括含有经修饰和未经修饰核酸的微生物，以及从所述微生物回收所述聚酮化合物类分子或巨内酰胺分子。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及编码用于合成聚酮化合物巨内酰胺(macrolactam)BE-14106的生物合 成机构的基因簇的克隆和测序，所述生物合成机构基因簇包含非核糖体肽合成酶(NRPS) 腺苷酰化结构域和模块型聚酮化合物生物合成酶或酶复合物(PKS ；聚酮化合物合酶或酶 复合物)。因此所述生物合成机构包含杂合NRPS-PKS酶系统。所以本专利技术涉及编码用 于合成巨内酰胺BE-14106的生物合成机构的新型基因和核酸分子，包括涉及BE-14106 生物合成的模块型NRPS-聚酮化合物生物合成酶或酶系统，并且所述生物合成机构包含 模块型NRPS-聚酮化合物合酶酶系统或其复合物(以及其组分)。本专利技术还涉及这些基 因、核酸分子、机构、酶和酶系统或其复合物在促进BE-14106生物合成中的应用以及在 BE-14106衍生物合成和新型巨内酰胺结构合成中的应用。
技术介绍
聚酮化合物或聚酮化合物类结构或聚酮化合物相关结构是由细菌、真菌、植物 和动物合成的天然产物，或形成了上述天然产物的基础，其中许多具有作为药物或作为 农业产品或兽医产品的应用潜力，例如作为抗生素、抗真菌剂、细胞生长抑制剂、抗胆 甾醇血症药、抗寄生物剂、抗球虫剂、动物生长促进剂和天然杀虫剂。革兰氏阳性细菌链霉菌(Streptomyces)是聚酮化合物和聚酮化合物类分子的主要 生产者，并且这些生物体中聚酮化合物生物合成的遗传学和生物化学已得到较好的表征 (McDanielR等；ChemRev.2005Feb ； 105(2) 543-58.)。其它生产者包括其它放线菌。已知有多种不同聚酮化合物类(或聚酮化合物相 关)分子，其中巨内酰胺代表一类。OgasawaraY.等于ChemBiol.2004Jan ； 11(1) 79-98 和 Udwary 等于 Proc Natl Acad Sci USA 2007Jun 19 ； 104(25) 10376-81 已经分别报道 了用于合成巨内酰胺文森他汀(vicenistatin)和萨利内酰胺(salinilactam)的生物合成基因簇。BE_14106(另一名称为GT-32A)是具有如附图说明图1所示化学结构的巨内酰胺抗生 素。其已经从类球形链霉菌(Streptomyces spheroide)菌株中得到分离，并且表明其具 有针对白血病细胞系的细胞毒性作用，以及针对许多所测试生物体的抗微生物活性， 针对H-ras转化BALB3T3细胞系的抗增殖活性和针对混合淋巴细胞反应的抑制活性 (JP4001179, Kojiri 等 1992Journal of Antibiotics, 868-74 ； Takahashi 等 1997，Journal of Antibioticsl86-8)。还已经从未指明的链霉菌属(Streptomyces)物种分离出8-脱氧类似 物(GT-32B)，并且显示其与BE-14106共有多种活性(Takahashi等，出处同上)。巨内酰胺化合物如BE-14106可以如下形成用激活的氨基酸激活和启动PKS系 统，以与脂肪酸生物合成类似的方式通过使用聚酮化合物合酶(PKS)重复缩合简单的羧 酸使氨基酸残基(氨酰基链)延伸。因此，与“起始单元”是羧酸残基的简单聚酮化合物 链的情况不同，在这种情况下，PKS的起始单元是由氨基酸和酰基链合成的氨酰基中间 体。PKS可以组织成以循环方式再利用结构域的迭代(iterative)PKS，或组织成含有一串分开模块(separate module)(或重复单元)并且不再利用结构域的模块型(I型)PKS。每 一模块负责聚酮化合物链合成中的一个缩合循环，并且含有各种酶结构域。在BE-14106 的情况下，严格而言，“聚酮化合物”链是杂合氨基酸-聚酮化合物链，或氨酰基链， 但是本文称之为“聚酮化合物链”。因此，除了通过酮酰合酶(KS)结构域催化而 将下一个羧酸缩合到生长中的聚酮化合物链的结构域之外，I型PKS的模块可以含有具有 β-酮还原酶(KR)活性、脱水酶(DH)活性或烯酰基还原酶(ER)活性的结构域，其确 定导入的延伸单元的还原状态。存在于每一模块中的酰基转移酶(AT)和酰基载体蛋白 (ACP)结构域分别负责延伸单元的选择和PKS上生长中的聚酮化合物链的保持。一旦完 成合成，通过硫酯酶(TE)的作用使聚酮化合物链从PKS释放，所述硫酯酶还可能涉及 最终产物的环化。因此，I型PKS表示聚酮化合物生物合成的装配线，其可以通过改变 模块的数量、其对羧酸的特异性，或通过失活或插入活性减少的结构域来操纵(Weissman 禾口 Leadlay，Nat.Rev.Microbiol.2005Dec ； 3(12) 925-36.)。聚酮化合物部分合成并环化 形成大环内酯(macrolactone)(或巨内酰胺)环后，可以经由羟基化、糖基化、甲基化和/ 或酰基化对其修饰。这些修饰对于某些聚酮化合物类产物的生物活性可能是重要的。在 导致本专利技术的工作中，编码BE-14106NRPS-PKS酶系统(BE-14016 “基因簇”)的基因 已被克隆和测序，并且已经 确定BE-14106NRPS-PKS酶系统含有几个I型PKS，其中各 PKS以模块方式组织，并且由重复单元(模块)组成，下文将对此进行更详细的描述。链霉菌(Streptomyces)中聚酮化合物生物合成的基因通常以簇的形式组织，已经 鉴定出许多这种簇，负责各种天然产物的合成。已经描述了链霉菌(Streptomyces)的几 种大环内酯抗生素基因簇的分子克隆和完成的DNA测序，包括除虫霉素(avermectin)、 苦霄素(pikromycin)禾口雷中白霄素(rapamycin) (Ikeda H., Omura S. (2002) .Biosynthesis, Regulation, and Genetics of Macrolide Production.在 Macrolide Antibiotics Chemistry, Biology and Practice,第二版(由 S.Omura 编)，第 286—326 页，Academic Press, New York.) 如上所述，还已经报道了某些巨内酰胺抗生素的生物系统的基因簇。如上指出以及如下所述，本专利技术基于用于迄今为止不可得到的BE-14106的生物 合成的新型基因簇的鉴定、克隆和测序。克隆基因的分析进一步阐明BE-14106的生物 合成途径。因此，现在提出BE-14106合成的正常过程通过合成起始单元(C17-C25)而 启动，此处酰基部分从1个丙酸酯和2个乙酸酯单元合成。NRPS腺苷酰化结构域激活甘 氨酸分子，并将激活的甘氨酸加载到肽基载体蛋白上，从而继续起始单元的合成。甘氨 酸的氧化脱氨基释放铵，其对C-17羰基进行亲核攻击从而形成C-17亚氨基，该C-17亚 氨基随后被还原成氨基。氨酰基链从肽基载体蛋白的释放导致羧酸的形成，该羧酸随后 被腺苷酰化并与辅酶A(CoA)连接。所得的激活的氨酰基-CoA通过酰基转移酶将转移 至IjPKS的ACP结构域，并通过以下更详细描述的PKS系统中的酶的顺续作用而延伸和修 饰。各模块中的酮酰合酶(K本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种核酸分子，所述核酸分子包含：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所示的核苷酸序列；或（ｂ）与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１互补的核苷酸序列；或（ｃ）与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１简并的核苷酸序列；或（ｄ）与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１具有至少８５％序列同一性（优选具有至少８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％或９９％序列同一性）的核苷酸序列；或（ｅ）（ａ）～（ｄ）中任一个的一部分，其中所述核酸分子编码一种或多种多肽，或与编码一种或多种多肽的核酸分子互补，或包含在聚酮化合物类分子或巨内酰胺分子的合成中具有功能活性的一种或多种遗传元件，或与包含在聚酮化合物类分子或巨内酰胺分子的合成中具有功能活性的一种或多种遗传元件的核酸分子互补。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢尔盖佐特切夫，汉恩内约尔根森，阿瓦尔斯列塔，特龙德厄尔灵埃林森，埃斯彭夫加尔威克，克里斯廷弗勒格斯塔德格涅斯，吉尔科林贝尔，佩尔布鲁海姆，
申请(专利权)人：辛文特公司，
类型：发明
国别省市：NO
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