得自胆汁的免疫调节组合物制造技术

一种用作免疫调节剂的组合物，含有分子量小于３０００Ｄａ的成分，并且具有下列特性： ａ．可从动物的胆汁中提取； ｂ．能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞； ｃ．能够调节肿瘤坏死因子的产生； ｄ．含有不可测水平的ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＮＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ或ＴＮＦ－γ； ｅ．在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用； ｆ．对人外周血单核细胞无细胞毒性；及 ｇ．不是内毒素。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫调节组合物，含所述组合物的药剂及所述组合物和药剂在治疗动物方面的应用。专利技术背景有关癌症和感染性疾病，如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的预防和治疗的疗法正在不断地发展。其中的一些疗法试图治疗性地利用免疫系统。有一种方法就是以免疫系统的抗原特异性成分即抗体和T细胞为基础的。例如，相关研究的目标集中在开发抗外源物质或抗某些内源性化学信使(如白细胞介素)的疫苗以抑制抗体反应。第二种方法是基于对免疫系统非抗原特异性部分之多肽和蛋白质的分离、克隆、表达和生产。例如，所述的蛋白质为所述的治疗提供了可能性，所述的蛋白质如包括由白细胞产生的白细胞介素和能刺激淋巴细胞及消化外源抗体之清道夫细胞的干扰素的细胞因子。如果抗肿瘤的早期免疫应答能被增加以使所述肿瘤的大小不致于达到致命的大小，那么对于肿瘤的治疗则可大大增强。已提出的增大抗肿瘤之免疫应答的策略包括对肿瘤相关性抗原有特异性的疫苗；利用抗肿瘤细胞表面上的抗原(如IL-2受体)的单克隆抗体；含有抗肿瘤抗体和超抗原之双特异性分子的应用。最近，已经研究了被称为肿瘤坏死因子(TNF)的生理活性多肽的作用，尤其是研究了其能够诱导肿瘤坏死而对活体的正常组织不产生影响的特性。美国专利4,879,226已公开了TNF的氨基酸序列和编码TNF之DNA的碱基序列。因为已经证明了TNF在诱导肿瘤坏死中的作用，所以任何能够在体内刺激TNF产生或其生物有效性的因子都具有用于治疗各种肿瘤疾病的潜力。此外，任何能在体外刺激人单核细胞和巨噬细胞产生TNF的因子都可用作提供治疗性施用TNF来源的工具以及用于分析和诊断目的。胆汁由肝脏分泌并贮存于胆囊中。出于种种目的，人们对胆汁进行了研究，包括利用胆汁提取物增强易于由正常肝功能合成的药物之生物有效性(参见WO 90/12583)和抑制哺乳动物中白细胞增多的促进作用(参见Shinoda et al.，Chem.Pharm.Bull.，30，4429-4434(1982))。然而，胆汁从未被考虑用作治疗肿瘤或感染性疾病的有用组合物。令人感兴趣的是，根据英国专利337,797的建议，胆囊本身可作为抗肿瘤剂的来源，但这仅仅在胆汁被从胆囊中取出且该胆囊被彻底清洗之后。专利技术概述已经发现，胆汁是提供能够在体外和体内刺激TNF产生并能有效地治疗各种癌症，尤其是胰腺癌之组合物的重要来源。所用的胆汁组合物可经用水溶性或可混性溶剂抽提胆汁而得。如此所得的提取物经进一步处理以除去不必要或不希望的成分。已经发现，经过在下文将进一步公开的抽提胆汁法所获得的产物具有TNF刺激活性，且据信具有抗癌活性，尤其是抗胰腺癌或其它种类的癌症。很显然，如此所得的完整组合物并非是得到上述活性所必需的。因此，有可能对所得的产物进行分离、分级分离或其它处理，并仍然保留所需的TNF刺激性和抗癌活性。而且可以设想，有可能通过合成方法得到具有相同或相似的TNF刺激性和抗癌活性的产物。因此，可以想象可以以产生所期望活性的各成分或其组合分析产物的各成分，并基于这些分析，得到合成的产物。本专利技术的一方面是涉及一种用作免疫调节剂的组合物，包括分子量小于3000Da的成分且具有一种或多种下列特性a.可从动物的胆汁中提取；b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；d.含有不可测水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GN-CSF或TNF-γ；e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；及g.不是内毒素。根据优选的实施方案，所说的组合物是自牛胆汁中提取，能够刺激肿瘤坏死因子的释放。本专利技术的组合物可由下列步骤制备(a)将得自动物(优选牛)的胆汁与一种水溶性或可与水混溶的溶剂(优选的是醇，而且优选的是等体积醇)混合，得到胆汁/醇溶液；(b)分离最好是醇溶性部分的所说溶液，通过除去大部分的醇(例如应用加热)而分离基本不含醇的溶液；(c)从该溶液中除去胆汁色素，得到无色液体；(d)可任意选择地处理所得的无色溶液以除去任何残留的醇；(e)除去有机脂物质如通过用醚抽提无色液体，并分离水相和(f)可任意选择地从水相中除去残余醚。所述组合物可在经简单地包装入瓶和高压灭菌后使用，勿需进行进一步的处理。该组合物也可以浓缩形式使用。优选的浓缩形式是按如下所述制备的在步骤(e)之前无色液体可被任意选择地浓缩至胆汁/醇溶液体积的约1/8，在步骤(f)之后，可以浓缩水相以使其体积为胆汁/醇溶液的1/10。本专利技术还涉及含有本专利技术新组合物的药剂。本专利技术进一步涉及治疗病人的方法，包括给所述病人施用有效量的本专利技术组合物。本专利技术还涉及本专利技术组合物在预防和治疗需要调节免疫应答的疾病及病理状态中的应用，尤其是在感染性疾病和肿瘤中的应用。本专利技术的上述及其它方面在参考下文的详细描述及附图后即可成为显而易见的。此外，本文参考了各种文献，这些文献全文引入本文作为参考。附图的简要说明本专利技术更详细的内容将借助下文在附图中得以图示说明的实施例进行描述，所述的附图中附图说明图1为本专利技术的一个浓缩组合物的HPLC图；图2为本专利技术的一个浓缩组合物的HPLC图；图3为本专利技术的一个浓缩组合物的HPLC图；图4为本专利技术的一个组合物的HPLC图；图5为本专利技术的一个组合物的HPLC图；图6为本专利技术的一个组合物的HPLC图；图7为本专利技术的一个组合物的HPLC图；图8图示说明本专利技术的组合物对LPS诱导的PBMN释放TNF的影响；图9是表明本专利技术组合物对LPS诱导的PBMN释放TNF之影响的条图；图10表示本专利技术的一个组合物的C18RP-HPLC图；图11表示对本专利技术组合物的沉淀部分进行RP-HPLC分析；图12表示对本专利技术组合物的可溶性部分进行RP-HPLC分析；图13表示胰腺癌的病人用本专利技术的组合物治疗后自诊断起的存活情况；图14表示胰腺癌的病人在用本专利技术的组合物治疗后自治疗时起的存活情况；图15表示用本专利技术的组合物治疗后所有黑瘤病人的存活情况；图16表示有两个或更多肿瘤部位的黑瘤病人在用本专利技术的组合物治疗后的存活情况；图17表示有三个或更多肿瘤部位的黑瘤病人在用本专利技术的组合物治疗后的存活情况；图18表示本专利技术的完整组合物的RP-HPLC图；图19表示本专利技术组合物沉淀物的RP-HPLC图；图20表示本专利技术组合物之上清液的RP-HPLC图；图21为本专利技术组合物的SDS凝胶分析；图22表示在亲水性HPLC上洗脱本专利技术组合物的条件和时间(a)以及本专利技术组合物之上清的洗脱图(b)；图23表示在亲水性HPLC上洗脱本专利技术组合物的沉淀物；图24表示本专利技术组合物在刺激外周血单核细胞功能中的剂量反应；图25是恶性黑瘤在用本专利技术组合物治疗前(25a)和治疗后的照片。本专利技术的详细描述如上所述，本专利技术涉及用作免疫调节剂的组合物，包括分子量小于3000Da的成分，并且具有下列特性a.可从动物的胆汁中提取；b.能够在体外刺激单核细胞和巨噬细胞；c.能够调节肿瘤坏死因子的产生；d.含有不可测水平的IL-1α、IL-1β、TNF、IL-6、IL-8、IL-4、GN-CSF或TNF-γ；e.在恶性小鼠杂交瘤细胞系中有抗增生作用；f.对人外周血单核细胞无细胞毒性；及g.不是内毒素。更确切地说，研究人员已经本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：R·兰格，
申请(专利权)人：罗拉斯医疗公司，
类型：发明
国别省市：