注射式血管化脂肪组织及其构建方法技术

本发明专利技术涉及构建血管的方法，注射式血管化脂肪组织及其构建方法。本发明专利技术采用自体细胞，模拟天然血管组织，用天然生物材料包裹组织细胞形成微球，利用微球间的孔隙作为血管形成通道，复合平滑肌细胞和内皮细胞形成血管结构，得到具有血管结构的人工组织；模拟天然血管组织，将脂肪干细胞包裹于天然材料中制成微球并结合血管化因子缓释系统，可构建出注射式的血管化脂肪组织。根据本发明专利技术，可在体外或体内构建出注射式血管化脂肪组织，其可用于小体积和大体积的软组织修复，能在体内长期稳定存在，手术创伤小，术后恢复快；也可用作体外生化或药物研究的模型。本发明专利技术所述的血管和人工组织的构建方法还可用于其他人工组织，如肝组织、软骨组织等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，特别是涉及一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪 组织及其构建方法。
技术介绍
每年全世界有数百万例患者，因为创伤、肿瘤切除术和先天性缺陷导致的软组织、 面部和乳房缺损，需要通过手术进行修复重建。由于乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一， 发病率高达10% 15%，并且还呈逐年上升和年轻化的趋势，肿瘤切除造成的软组织和乳 房缺损数量最多。据美国矫形外科医师协会报道，2004年全世界有超过500万人实行了乳 房重建手术，其中有400万是由于肿瘤切除。一般认为，理想的脂肪软组织填充材料应该与天然组织有相似的柔软性、相同的 渗透压、稳定的理化性能、良好的生物相容性、不致癌、不致敏、不致畸、不钙化等。目前较普 遍使用的乳房和面部填充及再造材料包括医用材料和自体移植物两大类。医用材料又包 括硅胶、聚丙烯酰胺凝胶、三酰甘油(甘油三酯)、透明质酸等植入型假体和液体石蜡、凡士 林等注射用混合物。目前的研究表明使用这些材料易出现假体破裂或渗漏、炎症反应、肉芽 肿、包膜挛缩、假体移位、感染、蒙道尔病等并发症，安全性受到很大的质疑。以硅胶假体为 例，1992年美国食品与药物管理局禁止了所有硅胶假体的使用。相对而言，自体移植物具有来源丰富，应用范围广泛，生物相容性好，无免疫排斥 反应，手感好，安全可靠及可调整等许多优点。针对小范围及小体积的缺损和塑性，自体脂 肪颗粒注射是目前临床经常使用的一种方案。该方法以自体脂肪颗粒作为人体组织填充材 料，无排斥反应，不存在致病、致癌性。取材来源于身体脂肪较多的部位，可以在填充同时可 进行吸脂手术，取得取多补少一举两得的效果。供区和受区几乎不留手术瘢痕，对人体的正 常解剖结构影响及副损伤都很小、安全持久。适应证广泛，几乎人体表皮下组织凹陷缺损均 可填充。自1889年Van der Meulen首次报道了脂肪组织的自体移植以来，该技术已成功 地应用于①面部凹陷性缺损或畸形，如颧部、颞部、额部、眶；②较深的皱纹、鼻唇沟及鞍鼻； ③上唇过薄，耳垂较小等；④乳房发育不良、哺乳后乳房萎缩，双侧乳房不对称及乳头凹陷； ⑤阴茎增粗、丰大阴唇、阴道松弛紧缩、手背软组织萎缩填充。该治疗方案缺点在于由于注 入到乳房内的脂肪颗粒不能很好地建立起血液供应系统，当大量脂肪堆集在一起，会因供 血不足导致脂肪细胞坏死、溶解、吸收，极易引发感染、血肿、变形、疼痛、硬结、囊肿、坏死等 后遗症。研究发现约有50% 60%的脂肪颗粒被吸收，存活下来的组织也逐渐被纤维化或 钙化，效果不持久，常需要多次注射维持形状。针对大体积的软组织缺损，尤其是乳房肿瘤切除术后的修复，目前多采用转移下 腹部皮瓣的手术治疗方案，通过显微外科血管吻合技术移植游离的肌皮瓣以达到隆乳目 的，其外形逼真、质地好、易于塑形，血运系统良好，但给供区不可避免地造成创伤和瘢痕， 引起功能障碍，如局部肌肉神经萎缩、腹部软弱和形成腹壁疝等，而且移植后吸收明显，效 果不能持久，尤其是当带蒂组织移植体的蒂部扭转或受压时可出现移植组织坏死等不良反应。患者常常难以接受此办法，移植物供体受到相应的限制。目前，应用组织工程学原理来构建脂肪组织已成为组织工程研究领域的热点之一。在种子细胞研究方面，由于成体脂肪细胞(个大、壁薄、内有脂肪颗粒)的不增殖 性和易受损伤性，人们将兴趣越来越多的转向具有特定分化潜能，良好自我更新和扩增能 力的干细胞。脂肪干细胞(adipose derived adult stem cells)已被证实能向脂肪细胞、 软骨细胞、心肌细胞，神经细胞及成骨细胞等多个方向定向转化。而自体脂肪干细胞具有可 供取材的脂肪组织来源丰富，抽取方便，可反复获得，操作损伤小，无免疫排异反应，细胞容 易培养，增殖速度很快等优点，已被越来越多的人所接受；另外，前脂肪细胞是一种类成纤 维细胞，能够增殖并特异性向脂肪细胞分化，可从经酶消化的脂肪组织或皮下脂肪抽吸物 中分离而来，对外界机械损伤的抵抗力较强。用普通的细胞培养方法就可以生长，并能够在 体外扩增及分化，目前脂肪组织工程的研究也主要集中在脂肪干细胞和前脂肪细胞。在支架材料方面，脂肪族聚酯类生物降解高分子中的聚乙醇酸(polyglyclic aicd)、聚乳酸(polylactic acid)及两者的共聚物(polylacticacid/polyglyclic aicd copolymers)、胶原等已用于动物实验。但存在主要问题是一方面常用的合成高分子材料 相对于乳房组织显得太硬，另一方面如果不能及时建立血供，复合细胞的可降解高分子材 料同样会被机体吸收，难以长期保持稳定。同注射型脂肪颗粒一样，材料和细胞被降解、吸 收，三维结构不稳定的主要因素仍然是无法及时建立血管网导致的血液供应不足。目前已有用微球体系构建血管网的研究，研究主要集中在用合成材料微球烧结后 形成的通道作为血管化的预留空间，然后复合内皮细胞，其效果良好，但是与脂肪组织相比 还是有很大的距离。综上所述，自体移植对于小体积和大体积缺损的修复都是目前较常用的治疗方 案，其中注射式脂肪颗粒最能被患者接受，但存在供给区创伤和吸收等不可克服的问题。脂 肪组织工程结合自体干细胞技术提供了一种很有前景的方向，但目前还未取得突破性的进 展，最大的难点在于供血不足引起的移植物降解、吸收或坏死。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种构建微血管的方法。本专利技术的另一目的是提供一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪组织及其构 建方法。本专利技术所述的构建血管的方法，是将组织细胞采用天然生物材料制成微球，利用 微球间的间隙作为形成血管的通道，构建血管，主要包括以下步骤1)将自体干细胞分别诱导为平滑肌细胞和内皮细胞，平滑肌细胞与涂覆材料均勻 混合，然后加入组织细胞微球，使其在培养空间能形成至少两层，进行培养，直至含有平滑 肌细胞的涂覆材料均勻分布在组织细胞微球表面并通过自组装作用将微球连接成整体，微 球之间的间隙形成通道；2)在通道内表面复合内皮细胞。本专利技术所述的构建血管的方法，在步骤1)之前，还包括构建组织细胞微球将组 织细胞包裹在海藻酸钠基水凝胶材料中，制成组织细胞微球；在步骤3)之后，还包括步骤4)将血管化生长因子包裹在海藻酸钠基水凝胶材料 中，制成细胞因子缓释微球，然后与步骤3)获得的组织均勻混合。步骤1)所述组织细胞微球和步骤4)所述细胞因子缓释微球可采用各种方法将组 织细胞或生长因子包裹在海藻酸钠基水凝胶材料中制成微球，优选非接触式高压静电法， 过程如下将组织细胞或生长因子以IO6 IO7个/ml的密度与海藻酸钠基水凝胶材料混 合后通过注射泵挤出，经过高压静电场的拉力滴入固化液中，制成组织细胞或生长因子微 球；其中，所述海藻酸钠基水凝胶材料可以是海藻酸钠、海藻酸钠/胶原、海藻酸钠/ 明胶、海藻酸钠/纤维蛋白原中的一种或多种；所述固化液为含二价阳离子的盐溶液，如氯 化钙、氯化钡等，优选氯化钙溶液。所述海藻酸钠基生物材料中海藻酸钠的最终浓度为1_10%，明胶、胶原或纤维蛋 白原的最终浓度为0. 01-5%，氯化钙溶液浓度为IOOmM 500mM。所述组织细胞微球或生长因子微球的粒径可根据本领域技术人员的需要来决定， 优选微米级，为便于配合，生长因子微球的粒径应小于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建血管的方法，包括以下步骤：１）将自体干细胞分别诱导为平滑肌细胞和内皮细胞，平滑肌细胞与涂覆材料均匀混合，然后加入组织细胞微球，使其在培养空间能形成至少两层，进行培养，直至含有平滑肌细胞的涂覆材料均匀分布在组织细胞微球表面并通过自组装作用将微球连接成整体，微球之间的间隙形成通道；２）在通道内表面复合内皮细胞。

【技术特征摘要】
一种构建血管的方法，包括以下步骤1)将自体干细胞分别诱导为平滑肌细胞和内皮细胞，平滑肌细胞与涂覆材料均匀混合，然后加入组织细胞微球，使其在培养空间能形成至少两层，进行培养，直至含有平滑肌细胞的涂覆材料均匀分布在组织细胞微球表面并通过自组装作用将微球连接成整体，微球之间的间隙形成通道；2)在通道内表面复合内皮细胞。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)之后，还包括3)将血管化生长因 子包裹在海藻酸钠基水凝胶材料中，制成细胞因子缓释微球，然后与步骤2)获得的组织均 勻混合。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述组织细胞微球和步骤3)所 述细胞因子缓释微球都采用非接触式高压静电法制备。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述组织细胞微球的粒径为IOOym 500 μ m ；所述细胞因子缓释微球的粒径为20 μ m 50 μ m。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述涂覆材料为细胞亲和力高、有自组装作 用的生物材料；优选选自胶原、纤维蛋白原、matrigel的一种或多种。6.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤2)如下进行将内皮细胞 悬液作为培养液，将步骤1)制备的组织利用脉动培养或普通培养方式进行培养，使内皮细 胞附着在所述通道的内壁，形成外壁为平滑肌细胞、内壁为内皮细胞的血管组织。7. 一种基于自体干细胞的注射式血管化脂肪组织，由以下步骤制备1)脂肪细胞微球的构建取脂肪干细胞，包裹于海藻酸钠基水凝胶材料内形成脂肪干 细胞微球，然后用成脂诱导培养液培养，使脂肪干细胞分化为脂肪细胞，得到脂肪细胞微 球；2)以权利要求1或4所述的方法构建血管，其中组织细胞为脂肪干细胞，包括i)将 脂肪干细胞分别诱导成平滑肌细胞和内皮细胞；ii)将平滑肌细胞与涂覆材料均勻混合； iii)加入脂肪细胞微球，与包含平滑肌细胞的涂覆材料均勻混合，使脂肪细胞微球在培养 空间能形成至少两层，进行培养，直至含有平滑肌细胞的涂覆材料均勻分布在脂肪细胞微 球表面并通过自组装作用将脂肪细胞微球连接成整体，微球之间的间隙形成作为构建微血 管的空间的通道；iv)在通道内...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚睿，颜永年，张人佶，栾杰，王小红，林峰，熊卓，张磊，卢清萍，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]