新颖的基因ＳＭＳ　４４制造技术

本发明专利技术涉及新颖的基因，其编码Ｌ－抗坏血酸（下文中也称为维生素Ｃ）和／或２－酮－Ｌ－古洛酸（下文中也称为２－ＫＧＡ）合成中涉及的蛋白质。本发明专利技术还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明专利技术还涉及经修饰的蛋白质和编码所述经修饰的蛋白质的多核苷酸以及经修饰的微生物，其中所述修饰对所述微生物中维生素Ｃ和／或２－ＫＧＡ生产的产率、产量和／或效率具有直接或间接的影响。本发明专利技术还包括使用经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的工艺。本发明专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素Ｃ和／或２－ＫＧＡ的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖的基因SMS 44本专利技术涉及新颖的基因，其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)和/或 2_酮-L-古洛酸(下文中也称为2-KGA)合成中涉及的蛋白质。本专利技术还涉及包含该新 颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片 段，以及它们的功能等同物。本专利技术还涉及经修饰的蛋白质和编码所述经修饰的蛋白质的 多核苷酸以及经修饰的微生物，其中所述修饰对所述微生物中维生素C和/或2-KGA生产 的产率、产量和/或效率具有直接或间接的影响。本专利技术还包括使用经修饰的多核苷酸序 列转化宿主微生物的工艺。本专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维 生素C和/或2-KGA的用途。维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲 料，尽管一些畜牧动物可自身合成维生素C。在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了 工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山 梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初 实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对 维生素 C 生产的发展被概括于 Ullmann，s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition,Vol.A27(1996)，pp. 547ff 中。维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因 此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从 L-山梨糖或D-山梨糖醇起始来生产2-KGA (这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C 的中间产物)，或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始 进行另一种发酵工艺来生产2-KGA。目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗 以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中，人们已在研究更加经济且环保 的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来直接生产维生素 C已在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类、酵母和乙酸细菌，其中使用了不同 的培养方法。已知能直接生产维生素C的细菌的例子包括，例如，来自Gluconobacter、 Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas 或 Escherichia属的菌株。已知酵母或藻类的例子包括，例如Candida、Saccharomyces、 ZygosaccharomycesλSchizosaccharomyces、Kluyveromyces 或 Chlorella0能吸收D-山梨糖醇用于生长的微生物通常具有能将该化合物氧化为普遍性的同 化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生长的微生物还拥有一种酶——NAD(P) H-依赖性L-山梨糖还原酶，该酶可将该化合物还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一 步氧化为D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成为很多微生物生长的优秀底物。例如，在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于Acetobacter、 Gluconobacter和Gluconacetobacter属)的情况下，这些微生物能将D-山梨糖醇转运进胞质溶胶(cytosol)，并通过胞质溶胶中的NAD-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶将其转 化为D-果糖。一些个体菌株，例如Gluconobacter oxydans IFO 3292和IFO 3293还 能将L-山梨糖转运进胞质溶胶，并通过胞质溶胶中的NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原 酶将其还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。在这些细菌中， Embden-Meyerhof-Parnas途径以及三羧酸循环并不具有完全活性，将糖导向中央代谢的主 要途径是磷酸戊糖途径。通过磷酸化反应从D-果糖获得的D-果糖-6-磷酸进入磷酸戊糖 途径，其被进一步代谢，产生以NAD (P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧 基化合物。乙酸细菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而为人们公 知。这些过程为人们所已知并通常被称为氧化发酵或不完全氧化，它们已被长时间应用于 食品和化学工业中，尤其是对醋和L-山梨糖的生产中。已知能用属于Gluconobacter属的 菌株从D-山梨糖醇或L-山梨糖进行不完全氧化获得的有用产物是2-KGA。乙酸细菌通过位于周质空间中、周质膜上或胞质中的不同脱氢酶来完成这些不完 全氧化反应。不同的脱氢酶使用不同的辅助因子，最常见的是用于膜结合酶或周质酶的PQQ 和FAD，以及用于胞质酶的NAD/NADP。虽然这些氧化反应的所有产物都通过外层膜分散回到外界水环境，但是它们中的 一些可被主动或被动转运进细胞，并进一步用于与生长和能量形成有关的代谢途径。细胞 中，氧化产物可被还原酶多次还原回它们的最初底物，然后被导向进入中央代谢。在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢中具有活性的蛋白质，尤其是酶和转运蛋白， 在本文中被称为涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此类蛋白质在本文中被缩写为SMS蛋白，其在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接 代谢中发挥作用。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢包括一方面，将这些化合物吸收进胞质溶胶，以 及进一步转化为可用于吸收途径的代谢物，所述吸收途径例如Embden-Meyerhof-Parnas 途径、磷酸戊糖途径、Entner-Doudoroff途径以及三羧酸循环，它们都涉及对于活的细胞的 生长和维持来说必要的全部关键的能量形成和合成代谢反应。另一方面，D-山梨糖醇或 L-山梨糖的代谢还包括通过所谓的不完全氧化过程将这些化合物转化为经进一步氧化的 产物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和维生素C。本专利技术的一个目的是提高维生素C和/或2-KGA生产的产率和/或生产能力。令人吃惊地，我们发现，SMS蛋白或此类蛋白的涉及对D-山梨糖醇、L-山梨糖或 L-山梨糖酮的吸收或转化或具有针对此的活性的亚基在对维生素C和/或2-KGA的生物技 术生产中具有重要作用。在一种实施方式中，本专利技术的SMS蛋白选自转移酶[EC 2]例如激酶和磷酸酶，优 选地选自转移含磷基团[EC 2. 7]，更优选地选自以含氮基团作为受体的磷酸转移酶[EC 2. 7. 3]。此外，本专利技术的SMS蛋白可选自与膜结合的PQQ依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、与 膜结合的L-山梨糖脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶、与膜结合的FAD依赖性的D-山 梨糖醇脱氢酶、胞质NAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、NAD(P)依赖性的D-山梨糖醇脱氢 酶(也被称为NADPH依赖性的山梨糖还原酶)、NAD依赖性的木糖醇脱氢酶、NAD依赖性的7醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
选自下组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由：（ａ）编码包含根据ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；（ｂ）包含根据ＳＥＱＩＤＮＯ：１的核苷酸序列的多核苷酸；（ｃ）包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组ＤＮＡ作为模板，并使用根据ＳＥＱＩＤＮＯ：３和ＳＥＱＩＤＮＯ：４的引物组，通过核酸扩增（例如聚合酶链式反应）来获得；（ｄ）多核苷酸，其包含编码被（ａ）至（ｃ）中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶［ＥＣ２］的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸转移酶［ＥＣ２．７］的活性；（ｅ）编码转移酶［ＥＣ２］，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶［ＥＣ２．７］的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及（ｆ）编码转移酶［ＥＣ２］，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶［ＥＣ２．７］多肽的多核苷酸，且其与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸至少６０％相同，例如７０％、８５％、９０％或９５％相同；构成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2008-1-10 08000364.3选自下组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码包含根据SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶[EC 2]的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]的活性；(e)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]多肽的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；构成。2.选自下组的经修饰的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码包含根据SEQID NO 6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQID NO 5的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组 DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的引物组，通过核酸扩增(例如聚 合酶链式反应)来获得；(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍 生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取 代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶[EC 2]的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸 转移酶[EC 2. 7]的活性；(e)编码转移酶[EC2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2. 7]的多核苷酸， 且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码转移酶[EC2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2. 7]的多核苷酸， 且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95% 相同；构成，并且其中所述多核苷酸包含至少一种下述突变，所述突变导致与相应的野生型 多核苷酸相比提高的转移酶[EC 2]活性，优选地导致提高的转移含磷基团的磷酸转移酶 [EC 2. 7]活性。3.根据权利要求2的多核苷酸，其中所述至少一种突变在被引入微生物后导致与带有 野生型多核苷酸的相应微生物相比提高的维生素C和/或2-KGA的生产。4.根据权利要求2或3的多核苷酸，所述多核苷酸编码带有至少一种下述突变的多肽， 所述至少一种突变位于对应于SEQ ID NO 2的氨基酸300和600之间位置的氨基酸位置 上。5.根据权利要求2到4中任一项的多核苷酸，其中所述至少一种突变位于对应于SEQ ID NO 2的第563位的氨基酸位置上，优选地是用1563置换T563。6.根据权利要求1到5中任一项的多核苷酸，其与允许在原核或真核宿主细胞中表达 的表达控制序列可操作地连接。7.含有根据权利要求1到6中任一项的多核苷酸的载体。8.由根据权利要求1到6中任一项的多核苷酸或权利要求7的载体编码的多肽。9.用根据权利要求1到6中任一项的多核苷酸或权利要求7的载体遗传工程改造的微 生物。10.根据权利要求9的微生物，其中与野生型微生物相比维生素C和/或2-KGA生产的 产率和/或效率提高。11.根据权利要求9或10的微生物，其能以300mg/l或更多的量从D-山梨糖醇直接生 产维生素C，所述的量是在20小时温育之后以静止细胞方法测量的。12.根据权利要求9或10的微生物，其能以800mg/l或更多的量从L-山梨糖直接生产 维生素C。13.根据权利要求9或10的微生物，其能以7g/l或更多的量从D-山梨糖醇生产 2-KGA。14.根据权利要求9到13中任一项的微生物，其生产出根据权利要求8的多肽，所述多 肽与野生型微生物相比具有增加的和/或提高的转移酶[EC 2]活性，优选地具有增加的和 /或提高的转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2. 7]活性。15.根据权利要求9到14中任一项的微生物，其中根据权利要求1到6中任一项的多 核苷酸被过表达。16.根据权利要求9到15中任一项的微生物，其包含选自下组的其它多核苷酸或此类 多核苷酸的互补链，所述组由(a)编码包含根据SEQID NO 8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根据SEQID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴斯坦切弗勒克斯，奈杰尔约翰芒希亚，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]