新颖的基因SMS 37制造技术

本发明专利技术涉及新鉴定出的基因，其编码Ｌ－抗坏血酸（下文中也称为维生素Ｃ）合成中涉及的蛋白质。本发明专利技术还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明专利技术还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素Ｃ中的用途，其中对所述多核苷酸和／或被编码的多肽的修饰对所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和／或效率有着直接或间接的影响。本发明专利技术还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法／工艺。本发明专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素Ｃ的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖的基因SMS 37 本专利技术涉及新鉴定出的基因，其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)合成中涉及的蛋白质。本专利技术还涉及包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片 段，以及它们的功能等同物。本专利技术还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被 编码的多肽的修饰对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或 效率有着直接或间接的影响。本专利技术还包括使用所述多核苷酸和经修饰的 多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本专利技术还涉及经过遗传工程改 造的微生物及其用于直接生产维生素C的用途。维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还 用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素 C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除 了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转 化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化 学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产 的发展被概括于Ullma皿，s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27 (1996)， pp. 547ff中。维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从屮分离出的酶的协助下 进行。因此，可通过发酵工艺，通过属于例如A^togw/ow'c/gem'ww属或 G/wco"o&cter属的菌株从L-山梨糖或D-山梨糖醇起始来生产2-酮基-L-古 洛糖酸(2-KGA，这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产 物)，或者通过属于G/wco"Wa"er属或属的重组菌株，从D-葡 萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛糖酸。目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中， 人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方 法。从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来直接生产维生素c已在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类、酵母和乙酸细菌，其中使用了不同的培养方法。已知能直接生产维生素c的细菌的例子包括，例如，来自 G7wco"o6acfer、 G7t/ccwflceto6acfer、 Jc"oZ "cte厂、 A^ogw/( m'c/gew/讓、尸朋toM、 尸化wi/owoW(X 或E^c/^n'c/w'a属的菌株。已 知酵母或藻类的例子包括，例如 Cfl"AJa 、 Sacc/^ramF"、能吸收D-山梨糖醇用于生长的微生物通常具有能将该化合物氧化为普 遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生长的微生 物还拥有一种酶——NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶，该酶可将该化合 物还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。被D-果糖 激酶磷酸化之后，D-果糖成为很多微生物生长的优秀底物。例如，在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于 Jceto6a"er、 G7wcom 6acter禾口 G7wcowaceto^acter属)的情况F， 这些微生 物能将D-山梨糖醇转运进胞质溶胶(cytosol)，并通过胞质溶胶中的 NAD-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶将其转化为D-果糖。 一些个体菌株，例如 G/wco朋kz"er oxy^"s IFO 3292和IFO 3293还能将L-山梨糖转运进胞质溶 胶，并通过胞质溶胶中的NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶将其还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。在这些细菌中， Embden-Meyerhof-Pamas途径以及三羧酸循环并不具有完全活性，将糖导 向中央代谢的主要途径是磷酸戊糖途径。通过磷酸化反应从D-果糖获得的 D-果糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径，其被进一步代谢，产生以NAD(P)H形 式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。乙酸细菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能 力而为人们公知。这些过程为人们所已知并通常被称为氧化发酵或不完全 氧化，它们己被长时间应用于食品和化学工业中，尤其是对醋和L-山梨糖的生产中。已知能用属于G/wco"okzcter属的菌株从D-山梨糖醇或L-山梨 糖进行不完全氧化获得的有用产物是2-KGA。乙酸细菌通过位于周质空间中、周质膜上以及胞质中的不同脱氢酶来 完成这些不完全氧化反应。不同的脱氢酶使用不同的辅助因子，最常见的 是用于膜结合酶或周质酶的PQQ和FAD ，以及用于胞质酶的 NAD綠DP。虽然这些氧化反应的所有产物都通过外层膜分散回到外界水环境，但 是它们中的一些可被主动或被动转运进细胞，并进一步用于与生长和能量 形成有关的代谢途径。细胞中，氧化产物可被还原酶多次还原回它们的最 初底物，然后被导向回到中央代谢。在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢中具有活性的蛋白质，尤其是酶和 转运蛋白(transporter)，在本文中被称为涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统 (Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此类蛋白质在本文中被縮写为 SMS蛋白，其在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢中发挥作用。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢包括 一方面，将这些化合物吸收进胞 质溶胶，以及进一步转化为可用于吸收途径的代谢物，所述吸收途径例如 Embden-Meyerhof-Pamas途径、磷酸戊糖途径、Entner-Doudoroff途径以及 三羧酸循环，它们都涉及对于活的细胞的生长和维持来说必要的全部关键 的能量形成和合成代谢反应。另一方面，D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢还 包括通过所谓的不完全氧化过程将这些化合物转化为经进一步氧化的产 物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和维生素C。本专利技术的一个目的是提高维生素C生产的产率和/或生产能力。令人吃惊地，我们发现，SMS蛋白或此类蛋白的涉及对D-山梨糖 醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的吸收或转化或具有针对此的活性的亚基在对 维生素C和/或2-KGA的生物技术生产中具有重要作用。在一种实施方式中，本专利技术的SMS蛋白选自氧化还原酶，优选 选自在供体的CH-OH基团上发挥作用的氧化还原酶，更优选选自 以NAD+或NADP+作为受体的氧化还原酶以及具有其它受体的氧化还原酶，最优选选自属于、 或的酶组的氧化还原酶，或者优选选自在供体的醛或氧代基团上发挥 作用的氧化还原酶，更优选地选自以NAD+或NADP+作为受体的 氧化还原酶。此外，本专利技术的SMS蛋白可选自与膜结合的PQQ依赖性的D-山梨糖 醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶、 与膜结合的FAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、胞质NAD依赖性的D-山 梨糖醇脱氢酶、NAD(P)依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶(也被称为NADPH 依赖性的山梨糖还原酶)、NAD依本文档来自技高网...

【技术保护点】
选自下述组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由：（ａ）编码包含根据ＳＥＱ　　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；（ｂ）包含根据ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的核苷酸序列的多核苷酸；（ｃ）包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组ＤＮＡ作为模板，并使用根据ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３和ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：４的引物组，通过例如聚合酶链式反应的核酸扩增获得；（ｄ）多核苷酸，其包含编码被（ａ）至（ｃ）中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有糖输出蛋白和／或糖醇输出蛋白的活性；（ｅ）编码糖输出蛋白和／或糖醇输出蛋白的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸互补；以及（ｆ）编码糖输出蛋白和／或糖醇输出蛋白的多核苷酸，且其与（ａ）至（ｄ）中任一项所定义的多核苷酸至少６０％相同，例如７０％、８５％、９０％或９５％相同；构成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：巴斯坦切弗勒克斯，克里纳豪克，奈杰尔芒希亚，安德烈亚沐菲勒，新城雅子，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]