用ＲＮＡ干扰控制线虫的组合物和方法技术

本发明专利技术涉及ＲＮＡ干扰抑制植物寄生线虫靶ｌｅｔ－７０基因的表达的用途，并且涉及具有对寄生线虫增加的抗性的植物的产生。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用RNA干扰控制线虫的组合物和方法 致病性线虫存在于美国各地，在南部和西部的温暖湿润地区 及在沙土中密度最大。大豆植物的最严重病虫-大豆胞嚢线虫(/fefen^/wa ^V"'w")在1954年首次于美国的北卡莱罗纳州发现。某些地区严重遭受大 豆胞嚢线虫(SCN)侵染，以至于不采用控制措施，则大豆生产不再可能是 经济的。尽管大豆是受SCN侵袭的主要经济作物，然而SCN寄生包括大 田作物、蔬菜、观赏植物和杂草的总计约50种宿主。00051线虫损伤的迹象包括在炎热时期矮化与叶子发黄及植物萎 蔫。然而，线虫侵染可以引起严重产量损失，而无任何明显的地上部分发 病症状。产量减少的主要原因归咎于地下的根损伤。受SCN感染的根矮缩 或矮化。线虫侵染也可以减少根上固氮结节的数目，并且可以使根更易受 其他土源性植物病原体侵袭。防治线虫侵染的常规方法包括在线虫侵染的土地中保持合理的土壤养分和土壤pH水平；控制其他的植物疾病以及昆虫与杂草病害；使用消毒措施，如仅在处理完线虫非侵染田地后才翻耕、播种和中耕线虫侵染的田地；在侵染的田地中工作后用高压水或蒸汽彻底清洁设备；不使用在侵染田地中生长的种子播种非侵染田地，除非这种种子已经得到正确地清洁；轮作受侵染田地并且用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和播种抗性植物品种。00111已经提出方法用于遗传转化植物以便赋予植物对寄生线虫增加的抗性。美国专利号5,589,622和5,824,876涉及线虫附着后在采食植物的部位内或其附近特异性表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子然后能够用于指导有害蛋白质或酶的特异性表达，或指导对靶基因或对一般细胞基因反义的RNA的表达。这些植物启动子也可以用于通过用含有与其产物被摄取后诱导线虫致死的基因连接的植物靼基因的启动子的构建体转化植物来在采食部位特异性赋予线虫抗性。 最近，已提出用RNA干扰(RNAi)(也称作基因沉默)作为控制线虫的方法。当与靶基因或mRNA的序列基本上相关的双链RNA(dsRNA)引入细胞中时，耙基因的表达会被抑制(参见例如美国专利号6,506,559 )。美国专利号6,506,559证明了 RNAi抗秀丽隐杆线虫广a^m WmM,Y/s e/eg朋s)中已知基因的有效性，但没有披露RNAi用于控制植物寄生的线虫的用途。0013] 已有提议采用靶向线虫必需基因的RNAi，例如PCT公开文本WO 01/96584、 WO 01/17654、 US 2004/0098761、 US 2005/0091713、US 2005/0188438、 US 2006/0037101、 US 2006/0080749、 US 2007/0199100和US 2007/0250947中提出的。US2007/0271630 、 US2007/0250947和WO2007/095469各自公开了大量的SCN基因，包括编码I类E2泛素缀合酶的基因，所述缀合酶被称为LET-70。抗秀丽隐杆线虫(C.elegans ) let-70基因在筛选关皿因中被鉴定出来，并且表型分析表明let-70活性的损失导致了胚和幼虫致死，它们在肌原纤维结聚集中有缺陷。纯化的LET-70可以刺激CHN-1和UFD-2 ( E4泛素缀合因子)的自身泛素化活性，并且此外，可以刺激UNC-45(肌球蛋白指导的伴倡蛋白)的CHN-l-和UFD-2-依赖型多泛素化(multiubiquitylation)。以这种方式，LET-70可以调节UNC-45降解和肌球蛋白聚集。RNA印迹分析和let-70-lacZ报道子融合显示let-70在发育的全部阶段(包括持久幼虫期)都大量表达；在成虫期以前在大多数体细胞組织中观察到强染色，当表达通常^皮限制在神经系统中(胚胎致死、成体致死、突出阴门)。 在另一个实施方案中，本专利技术提供了能够表达dsRNA分子库的转基因植物，其中每个dsRNA分子包含具有约19-24个核苷酸长度的双链区域并且其中RNA分子来自与let-70寄生线虫把基因的部分基本上相同的多核苷酸。图l显示了指定了来自大豆胞嚢线虫(H, glycines )和其它物种的对应核苷酸和氨基酸序列的SEQ ID NO的表。 如本文中所用，考虑到比较RNA和DNA序列时尿嘧梵替换 胸腺嘧咬，用于dsRNA的术语"基本上相同"意指dsRNA的一条链的核苷 酸序列与耙基因的20个或更多个连续核苷酸至少约80%-90%相同，更优 选地、与粑基因的20个或更多个连续核苷酸至少约90-95%相同并且最优 选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸至少约95%、 96%、 97%、 98%、 或99%相同或完全相同。20个或更多个核苷酸是指耙基因至少约20、 21、 22、 23、 24、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 1000、 1500个连续碱 基的部分或至多靶基因的全长。 如此处所用的术语"控制"当用于感染的上下文中时指感染的 降低或预防。减低或预防线虫的感染会使植物具有对线虫增加的抗性；但 是，这种增加的抗性并不意味着植物必须100%地抗线虫感染。在优选实 施方案中，在抗性植物中对线虫感染的抗性比对线虫无抗性的野生型植物 高10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%或95%。优型，但是不包含针对靶基因的双链RNA的植物。植物对线虫感染的抗性 可以是由于当线虫暴露于对关M因特异的dsRNA时，线虫的死亡、不 育、停止发育或移动性受损造成的。此处使用的术语"对线虫感染的抗性" 或"具有线虫抗性的植物，，指与野生型植物相比，植物避免线虫感染、杀死 线虫或阻止、减少或停止线虫的发育、生长或增殖的能力。这可以通过主 动过程达到，例如通过产出对线虫有害的物质，或通过^皮动过程达到，例 如含有降低的线虫所需的营养价值或不形成由线虫采食部位诱导的结构例 如合胞体或巨细胞。植物的线虫抗性水平可以以多种方法检测，例如，计 数能够在植物上建立寄生的线虫数量，或测量线虫发育时间、雌雄线虫的 比例，或对于胞嚢线虫计数在感染的植物的根部或植物分析系统中产生的 胞嚢数量或线虫卵的数量。0039若非上下文中另外说明，术语"植物"涵盖植物发育或成熟的14任何阶段，以及取自任何这样的植物的任何组织或器官(植物部分)。植 物部分包括，但不限于茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生组 织区、愈伤組织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、微孢子、原生质 体、毛根培养物等等。本专利技术还包括用本专利技术的植物制备的种子。在一个 实施方案中，与植物种子的野生型变体相比，种子确实被育种为有提高的 抗线虫感染的抗性。如此处所用，"植物细胞"包括但不限于，原生质体、 生产配子的细胞和再生为完整植林的细胞。植物多种组织的组织培养物和从这些组织培养物的植物再生为本领域所公知且已经充分^Hf 。 如此处使用的术语"转基因"指含有至少一个重组多核苷酸的 全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织或植物部分。在 许多情况下，重组多核苷酸的所有或部分被稳定整合入染色体中，或是稳 定的染色体外元件，从而能够传递至下一代。出于本专利技术的目的，术语"重 组多核苷酸"指的本文档来自技高网...

【技术保护点】
双链ＲＮＡ分子，其包含（ａ）具有与靶基因的约１９至约４００或５００个连续核苷酸基本上相同的序列的第一链，所述靶基因具有选自ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１的核苷酸７５－５７４、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的核苷酸１至５４８、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３的核苷酸１至７１５和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４的核苷酸１至６６８的序列；和（ｂ）具有与第一链基本上互补的序列的第二链。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：P任，S乔杜里，LW塔尔顿，黄翔，J麦克米伦，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]