用于测量存在于生物学流体样品中的微颗粒的纤溶酶活性的方法及用途技术

本发明专利技术的目标在于用于测量生物学流体，特别是处于流动状况下的生物学流体的样品的微颗粒，特别是循环微颗粒的纤溶酶活性的方法，所述方法可以用作诊断方法或用作对治疗进行追踪的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量存在于生物学流体样品中的微颗粒 的纤溶酶活性的方法及用途本专利技术的目标在于用于测量存在于生物学流体，特别是处于流动 状况下的生物学流体的样品中，或者存在于组织提取物中的微颗粒， 特别是循环微颗粒的纤溶酶活性的方法，所述方法可以用作诊断方法 或用作对治疗进行追踪的方法。由于细胞膜的出芽而导致的微颗粒已经在各种细胞模型中和在许 多病理状态中被描述为细胞的激活和/或凋亡的可靠标志物。具体而言，本专利技术人最初描述了，内皮细胞响应于炎性刺激而释 放这些微颗粒，以及在呈现出血栓形成风险的患者中内皮循环微颗粒 的量增加。此后，在不同的病理状态例如冠状动脉综合征，肾功能不全，糖尿病，抗磷脂综合征(APLS)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP) 或镰状细胞病，其中微颗粒的存在反映了内皮功能障碍并且为预后不 良的指示的病症之中描述了升高的内皮循环微颗粒的水平。因为^:颗粒表达来源于它们所源自的细胞的各种生物活性组分， 所以它们可以呈现出广泛范围的生物学活性，所述生物活性能够调节 内皮细胞或血细胞的功能，影响血管的内环境稳定，和参与炎症反应 或血管发生。例如，微颗粒，特别是循环微颗粒，呈现出在凝血因子的装配和 激活中所牵涉的促凝血磷脂表面。同样地，微颗粒特别是循环微颗粒参与凝血酶的产生是由于它们 在血管腔隙中表达、转移或诱导组织因子的能力而引起的。在止血平衡的主要调节剂中，纤溶酶原激活系统是用于溶解纤维 蛋白凝块的主要生理学途径。这个途径还通过帮助细胞外基质的组分 的蛋白水解而促进血管发生。纤溶酶原向活性纤溶酶的转化依赖于两种丝氨酸蛋白酶组织纤溶酶原激活物(t-PA:组织型纤溶酶原激活物)，其在血管中主要牵 涉纤维蛋白溶解；和尿激酶(u-PA:尿激酶型纤溶酶原激活物)，其 通过与其特异性受体uPAR结合而牵涉细胞外周蛋白水解。由uPA所诱导的纤溶酶产生和由此导致的基质金属蛋白酶(MMP) 的激活有助于细胞穿过间质基质的迁移，并且参与诸如组织重塑、转 移性侵袭和血管发生的过程。纤溶酶原的不受控制的和/或过度的激活可能通过诱导细胞脱离 和/或细胞凋亡而具有有害的后果。因此，意识到，调节在细胞特别是 内皮细胞的表面上纤溶酶的表达在血管内环境稳定的调节中具有至关 重要的重要性。因此，通过阅读上文，可以意识到在下列方面的益处 一方面能 够评估在生物学流体中，特别是在处于流动状况下的生物学流体，非 常特别是血液中，或者在组织提取物中，微颗粒，特别是循环颗粒的 "纤溶酶活性"的产生；和另一方面能够调节这种活性。"生物学流体，，意指任何可提取的体液，包括例如血液、脑脊液 (CSF)、支气管肺泡液(BAF)、尿液、滑液、母乳、唾液、泪液、 精液、腹水、胸腔积液、羊膜液。"处于流动状况下的生物学流体"意指天然地在身体内或在身体 外流动的任何体液，包括例如循环血液、母乳、尿液、唾液、泪液、 精液、月经流出物和任何其他浆液性和/或粘液性流出物。在组织提取物的来源中，可以提及动脉粥样化斑块或任何其他通 过外科手术获得的组织。在本文中，术语"纤溶酶活性"应当理解为包含微颗粒(特别是 循环微颗粒)的生物学流体(特别是处于流动状况下的生物学流体) 的样品产生纤溶酶的能力，无论应用何种机制。作为诊断方法，在包含微颗粒(特别是循环微颗粒)的生物学流 体样品中测量"测试样品的纤溶酶活性"的值，并且与在获自被称为 "正常"(即不呈现病理学状况)的个体的对照样品中这一相同能力 的测量相比较，如果其显著大于对照的纤溶酶活性值，那么将会反映，例如但不限于，对于个体来说具有或多或少升高的例如遭受由于增加 的动脉粥样化斑块的不稳定性而引起的血管意外的风险，对于患有癌 症的个体来说具有或多或少升高的遭受转移性侵袭的风险，或者对于 个体来说具有或多或少升高的遭受脑血管意外及其对于大脑功能的有 害后果的风险。如果"测试样品的纤溶酶活性"的这个值小于对照的 纤溶酶活性值，那么它将会例如反映对于其血液进行了测试的个体来 说具有增加的血栓形成风险。作为治疗的追踪，在来自正进行治疗的个体的生物学流体样品(特 别是处于流动状况下的生物学流体)的微颗粒(特别是循环微颗粒) 中测量"测试样品的纤溶酶活性"的值，并且与在治疗前或在治疗早 期获自同一个体的对照样品中这一相同能力的测量相比较，所述"测 试样品的纤溶酶活性"的值使得能够追踪所述个体根据施用给其的治 疗所作出的应答的演变。然而，依然存在有对于下列方面的需要即用于患者所承受的与 其血液的太强或太弱的纤溶酶活性相关的风险的简单、有效且可靠的 测试，或者用于追踪治疗(其旨在调节个体的生物学流体(特别是处 于流动状况下的生物学流体)的微颗粒(特别是循环微颗粒)的纤溶 酶活性)的演变的简单测试。提供此类测试是本专利技术的目的之一。事实上，在长期工作后，令人惊讶地，本专利技术人以其知识首次显 示，存在于个体的生物学流体，特别是处于流动状况下的生物学流体， 特别是血液中的循环微颗粒具有赋予它们产生纤溶酶的能力的生物学 活性。基于该发现，本专利技术的目标在于用于测量事先抽取的生物学流体 (特别是处于流动状况下的生物学流体，特别是血液)的样品的微颗 粒(特别是循环微颗粒)的纤溶酶活性的方法，其中-在第一步骤中，分离出存在于所述样品中的微颗粒，特别是循 环微颗粒，-在第二步骤中，通过任何合适的方式来测量在步骤1中分离出的所述微颗粒产生纤溶酶的能力，和-在第三步骤中，将在步骤2中获得的测量结果与在相同条件下 对于对照相同生物学流体的样品所进行的相同测量的结果相比较。根据本专利技术的一种变化形式，所述对照相同生物学流体可以为与 所测试的生物学流体相同但来源于至少一个祐^人为健康(即不呈现病 理学状况，至少不呈现其生物学流体被测试的个体所遭受的病理学状 况)的个体的生物学流体，从而使得能够就被认为正常的值而言来评 估所述个体的风险。根据本专利技术的另 一种变化形式，所述对照相同生物学流体可以为 与所测试的生物学流体相同、来源于同 一个体但在提供了测试样品的 那次取样之前例如在治疗开始前的取样中获得的生物学流体，以便能 够建立对于例如在治疗过程中微颗粒产生纤溶酶的能力的演变的追 踪。根据本专利技术，该方法的第一步骤(分离出存在于样品中的微颗粒， 特别是循环微颗粒)可以根据与此类微颗粒的分离相容的任何程序来 进行。例如，可以提及高速离心或者生物捕获技术，不论捕获支持物 是什么(例如，抗体，例如膜联蛋白V的抗体)。依照根据本专利技术的方法的第 一步骤的一种优选的变化形式，微颗 粒(特别是循环微颗粒)可以通过在这样的程序中的一系列离心和超 速离心来进行分离，根椐所述程序，- 在步骤1A中，在2-6'C ，优选地3-5。C的温度下，以1000 g-MOO g，优选地1200 g-1800 g的速度，使体积为500 jil-5 ml，优选地1 ml-2 ml的事先抽取的生物学流体，特别是处于流动状况下的生物学 流体，例如血液的样品离心5分钟-20分钟，优选地10-15分钟的时 间；- 在步骤1B中，在2-6。C，优选地3-5。C的温度下，以10000 g-20000 g，优选地12000 g-15000 g的速度，使在步骤1A中获得的 上清液离心1分钟-5分钟，优选地2-3分钟的时本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于测量事先抽取的生物学流体，特别是处于流动状况下的生物学流体，非常特别是血液的样品的微颗粒，特别是循环微颗粒的纤溶酶活性的方法，其中　－在第一步骤中，分离出存在于所述样品中的所述微颗粒，　－在第二步骤中，通过任何合适的方式来测量在步骤 １中分离出的所述微颗粒产生纤溶酶的能力，和　－在第三步骤中，将在步骤２中获得的测量结果与在相同条件下对于对照相同生物学流体的样品所进行的相同测量的结果相比较。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：E安格莱斯卡诺，R拉克鲁瓦，F马拉泰尔，F迪尼奈乔治，
申请(专利权)人：国家健康医学研究所，公共救济事业局马赛医院，地中海大学，下诺曼底卡昂大学，
类型：发明
国别省市：FR[法国]