具有高效分泌信号序列的哺乳动物表达载体制造技术

本发明专利技术涉及基于哺乳动物细胞的表达和分泌系统，及利用分泌性信号肽表达和分泌重组蛋白。本发明专利技术也涉及使哺乳动物细胞，具体是ＣＨＯ细胞分泌异源基因所用的表达盒。本发明专利技术还涉及使哺乳动物细胞，如ＣＨＯ细胞分泌异源蛋白的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有高效分泌信号序列的哺乳动物表达载体本专利技术涉及基于哺乳动物细胞的表达系统，及利用分泌性信号肽表达和分泌重组蛋白。本专利技术也涉及使哺乳动物细胞，具体是CHO细胞分泌异 源基因的表达盒。本专利技术还涉及使哺乳动物细胞，如CHO细胞分泌异源蛋 白的方法，和利用哺乳动物宿主细胞生产分泌性重组蛋白的方法。可利用各种各样经基因工程改造的生物，包括原核和真核细胞来生产 医学、研究和兽医应用所需的重组多肽。然而，许多这些蛋白是糖蛋白， 需要翻译后修饰。因此，原核宿主细胞如细菌细胞不适合。为此理由，开 发了利用高等真核细胞，如昆虫细胞或哺乳动物细胞的其它蛋白表达系统。 病毒表达系统能在昆虫和小鼠细胞系中产生重组蛋白，但具有几种严重缺 点，特别是纯化病毒感染系统中的重组蛋白问题很多。生产和回收重组多肽生物技术存在的主要问题是经基因工程改造的生 物其胞内蛋白或蛋白亚基不易分泌。这些胞内蛋白或蛋白亚基在细胞内常 常只中等水平表达，它们的纯化必须包括先裂解细胞，然后经几步程序使 所需多肽与其它胞内蛋白分离。解决这些问题的一种方法是使重组蛋白分泌到周质间隙或培养基中。 只要可能分泌是优选策略，因为能够容易而有效地纯化胞外培养基中的重 组蛋白。此外，分泌产生的重组蛋白优点是可避免被蛋白酶水解并且蛋白 质正确折叠的机会更优。蛋白质的成功分泌要求蛋白质能有效穿越内质网 膜或胞质膜转运。细胞分泌通过细胞膜的蛋白质在细胞内一般为其前体形 式，称为"前蛋白"。这种"前蛋白"形式在其氨基末端含有一附加的肽 序列，此附加序列为初生肽链靶向内质网使其能进入分泌通路所需。此附 加肽序列称为信号序列。然而，已知分泌常常不能达到所需程度，例如，重组蛋白自身的天然 信号序列在宿主细胞中常常不能很好运作。迄今，每种表达系统都需要专 门定制才能符合每种蛋白生产的需要以确保其正确折叠、活性和所需的产3量。虽然已鉴定到可用于具体重组蛋白质分泌的相当多的信号序列，但该 领域仍然需要能够促进哺乳动物宿主细胞有效分泌重组蛋白，特别是免疫 球蛋白的其它信号序列。因此，本专利技术要解决的技术问题是提供一种使真核宿主细胞，如中国 仓鼠卵巢(CHO)细胞能有效分泌非分泌性活性多肽，具体是抗体链的方法。本专利技术通过提供一种能使哺乳动物宿主细胞，特别是CHO细胞分泌异 源蛋白的表达盒而解决了此技术问题，此表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的DNA序列， 其中，编码该信号肽的DNA序列选自SEQIDNo.2、 SEQIDNo.4、 SEQ ID No.6、 SEQIDNo.8、 SEQIDNo.lO，或编码SEQ ID No,l 、 SEQIDNo.3、 SEQIDNo.5、 SEQIDNo.7、 SEQ ID No.9所示氨基酸序列的DNA序列。本专利技术的专利技术人发现，表达盒中所用的信号序列能使与其操作性相连 的多肽序列在哺乳宿主细胞中适当加工和有效分泌。作为初步筛选，测试 了 19种不同的信号序列，它们衍生自常规用于重组蛋白生产的与CHO细 胞不同物种的不同分泌性蛋白质，其中只有5种导致所测试多肽分泌的改 进。因此，这些实验证明一般不能预测来自一种物种的信号序列在另一物 种中是否也具有功能。上述5种信号序列中的二种，名为V19(SEQ ID No.9)和V17(SEQ ID No.7)的序列可导致细胞系分泌的抗体平均浓度比对照细胞系特别强地增 加。根据信号肽V19的氨基酸序列产生了以下信号肽的共有氨基酸序列 MMRPnCATVHC。因此，本专利技术也通过提供具有通用氨基酸序列MMRPnCATVHC的信号序列解决了上滩技术问题。在哺乳动物宿主细胞，如 CHO细胞中这二种信号序列能使与其操作性相连的多肽序列如抗体链有效 分泌。此序列中心区的疏水氨基酸宜选自丙氨酸(Ala或A)、异亮氨酸(Ile 或I)、亮氨酸(Leu或L)、苯丙氨酸(Phe或F)、甲硫氨酸(Met或M)和缬氨酸(Val或V)。 Ala的亲水指数为1.8， lie的亲水指数为4.5， Leu的亲水指 数为3.8， Phe的亲水指数为2.8， Met的亲水指数为1.9， Val的亲水指数 为4.2。中心的疏水氨基酸延伸链宜由Leu(L)与一些Val、 Ala、 Phe和lie组成。中心的疏水氨基酸延伸链长度宜为4-9个氨基酸残基。优选中心疏 水区包含4-16个氨基酸残基，特别优选4-9个残基。本专利技术也涉及使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒 包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编 码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自编码氨基 酸序列MMRPnTSALA的DNA序列，或编码氨基酸序列 MKTnCATVHC的DNA序列，其中n是4-16之间的整数， 所述疏水氨基酸选自丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或 缬氨酸。在一特别优选的实施方式中，编码所述信号序列的DNA序列选自SEQ ID No.8或SEQ ID No.lO，或编码SEQ ID No.7或SEQ ID No.9所示氨基酸 序列的DNA序列。本专利技术还涉及使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒 包含的启动子功能性连接于编码信号肽的DNA序列，该序列框内连接于编 码异源蛋白的DNA序列，其中，编码该信号肽的DNA序列选自SEQ ID No.2、 SEQIDNo.4、 SEQ ID No.6、 SEQ ID No.8、 SEQIDNo.lO,或编码 SEQ ID No. 1、 SEQIDNo.3、 SEQIDNo.5、 SEQ ID No.7、 SEQ ID No.9所 示氨基酸序列的DNA序列。在本专利技术的内容中，"表达盒"由要表达的一个或多个基因和调控它 们表达的序列如启动子/增强子序列组成，包括顺式作用转录控制元件的任 何组合。调控基因表达，即基因转录和转录产物的翻译的序列通常称为调 控单元。调控单元的大部分位于异源基因编码序列的上游并与其操作性相 连。该表达盒也可包含含有聚腺苷酸化位点的下游3'非翻译区。本专利技术的 调控单元或直接与要表达的基因即转录单元相连，或与其分开中间插入例 如异源基因的5'非翻译区DNA。该表达盒优选侧接有一个或多个合适的限 制性位点以便能将该表达盒插入到载体中和/或可从载体中切割下来。因此，，特别是哺乳动物表达载体。在本专利技术的内容中，术语"异源编码序列"、"异源基因序列"、"异 源基因"、"重组基因"或"感兴趣基因"可互换使用。这些术语指编码 重组或异源蛋白产物，寻求在哺乳动物细胞中表达并以高产量收获的DNA 序列。所述基因产物可以是蛋白或多肽，但也可以是肽。所述异源基因序 列非天然存在于宿主细胞中，可衍生自不同物种的生物。所述基因产物可以是任何感兴趣的蛋白质，例如治疗蛋白质如白介素， 或酶，或多聚蛋白质的亚基如抗体或其片段。所述蛋白优选抗体或工程改造的抗体或其片段，最优选免疫球蛋白G(IgG)抗体。按照本专利技术，术语"信号肽"或"信号序列"可互换使用，指分泌的 膜结合蛋白质氨基末端的连续延伸氨基酸残基短链。该信号肽能使所述蛋 白靶向分泌通路，使蛋白易化至内质网膜中后从其新生链上切断。信号肽由以下三个区域组成 一个氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种使哺乳动物宿主细胞分泌异源蛋白的表达盒，该表达盒包含的启动子功能性连接于编码信号肽的ＤＮＡ序列，该序列框内连接于编码异源蛋白的ＤＮＡ序列，其中，编码该信号肽的ＤＮＡ序列选自：编码氨基酸序列ＭＭＲＰ［疏水性氨基酸］ｎＴＳＡＬＡ的ＤＮＡ序列，或编码氨基酸序列ＭＫＴ［疏水性氨基酸］ｎＣＡＴＶＨＣ的ＤＮＡ序列，其中ｎ是４－１６之间的整数，所述疏水氨基酸是Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ或Ｖ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：R杨，J兰斯，
申请(专利权)人：英国龙沙生物医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]