脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法。具体地说，本发明专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗是以脊髓灰质炎减毒病毒为起始株制备的。本发明专利技术还涉及预防人受试者中脊髓灰质炎的方法。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脊髓灰质炎灭活疫苗及其制备方法。具体地说，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗是以脊髓灰质炎减毒病毒为毒种制备的。本专利技术还涉及预防脊髓灰质炎的方法。
技术介绍
脊髓灰质炎是由脊髓灰质炎病毒引起的、传播广泛、危害极大的急性传染病。50年代中末期脊髓灰质炎灭活疫苗和口服活疫苗(IPV和OPV)相继问世。IPV和OPV的使用有效降低了脊髓灰质炎的发病率。自1988年WHO提出消灭脊髓灰质炎目标后，全球发病报告数由1988年35万例下降至2003年不足700例，发病地区也由1988年的125个国家减少到6个。我国于1959年底研制成功OPV。其生产过程是将减毒株脊髓灰质炎病毒I、II、III型分别接种人胚肺二倍体细胞(简称2BS)，病毒繁殖扩增后直接收获病毒悬液，按一定比例将三型病毒合并即得。该疫苗的病毒滴度比较低，有时不能达到《中国生物制品规程》(2000年版)中“口服脊髓灰质炎减毒活疫苗制造及检定规程”要求，时常需要进一步浓缩。而且，人二倍体细胞有一定寿命，培养方法和规模受到限制。从1960年在中国开始使用OPV到1990年，发病率从3.18/10万降至0.24/10万。1994年9月，全国最后一例由野毒株引起的脊髓灰质炎消灭，至此，本土野毒株病毒在我国彻底消灭。然而，伴随着OPV的广泛使用，疫苗变异株感染病例明显增多。变异株病毒有疫苗相关病毒(vaccine-associated poliovirus，VAPV)，和疫苗衍生病毒(vaccine-derived poliovirus，VDPV)两种。VAPV主要发生在OPV免疫者及与其接触的易感染者中。在流行病学上与服OPV疫苗有关，其中少数感染者可出现急性迟缓性麻痹症。分离的病毒的核苷酸序列与Sabin株的差异小于1％。VDPV主要发生在未免疫人群中，与是否服OPV无关，可发生人与人之间的持续传播，并出现成群病例，常为永久性麻痹，分离的病毒的核苷酸序列与Sabin株的差异大于1％，其神经毒力已回复。通过序列分析确定，VDPV为Sabin株三型病毒的重组体。2000年7月-2001年9月，美洲区多米尼加共和国和海地发生了I型VDPV引起的脊髓灰质炎爆发，2001年菲律宾发现3名儿童因VDPV感染引起麻痹。2002年马达加斯加有4名儿童因VDPV感染而麻痹。2000年日本在污水中也检测到III型VDPV。对病例的回顾性分析发现，埃及1988年和1993年也发生VDPV引起的脊髓灰质炎爆发，在此期间有32例II型VDPV引起的麻痹病例。据2004年WHO统计，全球疫苗相关病例(即由VAPV引起的脊髓灰质炎)的发生率为2～4/100万；从1963到2004年VDPV鉴定出约20种。减毒株病毒基因组发生的自然回复突变使VAPV和VDPV必然存在。因此，在我国野毒株引起的麻痹型脊髓灰质炎已经完全消灭的情况下，使用OPV的风险远大于效益。目前国际上广泛使用的另一种疫苗是灭活疫苗，与OPV有两点主要不同其一，生产用毒种为野毒株；其二，病毒经纯化、灭活。IPV可产生体液免疫，没有潜在突变及毒力回升之虑。这些广泛使用的灭活脊髓灰质炎疫苗有传代猴肾细胞IPV，灵长类胚胎二倍体细胞系IPV和Vero细胞系IPV。由饲养猴传出二代到三代猴肾细胞制备疫苗，能减少猴源病毒的污染，在此传代水平也没有致瘤性。但超过此代次后，细胞生长速度开始减慢，至第六、第七代，细胞停止生长。用二倍体细胞制备IPV，控制了细胞培养的病毒污染。但是细胞对培养液的高要求尤其是血清的要求，使该细胞从经济和技术上不适合大规模培养。另外病毒产量低也是一个缺点。用Vero细胞制备IPV，优点是该细胞系已经被证明不含有细菌、霉菌和支原体的污染，没有致瘤性，胞核学稳定，可在微载体反应器系统大规模培养，是制备疫苗的理想基质。法国1982年研制成功Vero脊髓灰质炎灭活疫苗。但是，以上所述的各种IPV的生产用毒株都是强毒株，常用的I型毒种为Mahoney株、Brunhilde株、Brunder株，II型毒种为MEF-1株，III型毒种为Saukett株。这些毒株的特点是具有较强的神经毒力。随着脊髓灰质炎在更多国家和地区日趋消灭，实验室来源的野毒株给全球消灭脊髓灰质炎带来新的威胁。另一方面，采用野毒株病毒生产IPV需要在生物安全三级实验室进行，通过对操作间的气流控制和对排放物质的严格消毒，防止病毒泄漏至环境中或感染操作人员，如此生产不仅增加疫苗生产成本，而且不便于大规模生产。另外，随着全球消灭脊灰的目标越来越接近，人类自然感染脊灰病毒机会越来越少，而由于使用野毒株病毒生产疫苗(W-IPV)可能造成的实验室泄漏对人类的威胁显得越来越大。本专利技术的目的在于克服以上所述OPV和现有IPV的缺陷。
技术实现思路
本专利技术提供了一种制备脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，其中使用脊髓灰质炎减毒病毒株作为起始株生产灭活疫苗(S-IPV)。在另一方面，本专利技术涉及由本专利技术的方法制备的脊髓灰质炎灭活疫苗。本专利技术还涉及预防脊髓灰质炎的方法，包括对有此需要的个体施用有效量的本专利技术脊髓灰质炎灭活疫苗。具体实施例方式在本专利技术中，脊髓灰质炎灭活疫苗是以减毒株为毒种进行的。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种脊髓灰质炎灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤 a，培养来自细胞系的细胞；b，在细胞长成致密单层时，接种脊髓灰质炎减毒株病毒；c，病毒在细胞中增殖；d，收集细胞所产生的病毒悬液；e，通过澄清过滤去除细胞残渣；f，通过超滤浓缩病毒悬液；g，通过凝胶过滤层析步骤和离子交换层析步骤纯化病毒液；h，通过灭活剂灭活病毒；i，配制灭活疫苗。在本专利技术中，所用的细胞系可以是常规用于增殖脊髓灰质炎减毒株病毒的任何细胞，它们可以从WHO获得。所述细胞可以是二倍体细胞系或Vero细胞系，优选是Vero细胞。细胞的培养可以如下进行将合适的细胞系例如Vero细胞在15L转瓶内1∶6分种，培养5天后接种脊髓灰质炎减毒株病毒。或者，所述细胞是二倍体细胞系，将该二倍体细胞在15L转瓶内1∶2分种，培养7天后接种脊髓灰质炎减毒株病毒。所述细胞可以由工作细胞库复苏、经传代扩增得到。细胞培养可以依常规方法进行，例如在15升转瓶内进行，也可以在发酵罐内进行。在发酵罐中可以使用微载体，例如Cytodex1TM，Cytodex2TM，Cytopore(Pharmacia公司)，优选Cytodex1TM。其使用浓度可以是1-10g/L；优选3g/L。该微载体适合于Vero细胞生长，维持时间可达一个28天。优选在细胞密度达到3×106时对细胞接种病毒，例如对培养4天的细胞种毒。在本专利技术的方法中，可以采用任何减毒的脊髓灰质炎病毒进行接种，例如Sabin株、Sabin纯化株、中III2株或经批准的其他减毒株。优选地，I、II型用Sabin株(WHO提供)；III型用Sabin纯化株(WHO提供)。这些减毒的脊髓灰质炎病毒均可从WHO获得。可以以任何合适的感染复数接种脊髓灰质炎病毒减毒株。优选地，感染复数(MOI)是0.01-0.1。用于病毒增殖的培养基为常规培养基，如199，MEM。它们可以由合适的生产商购得，例如美国SIGMA公司。或者，还可以按照已公开的配方配制合适的培养基。培养基中应尽可能少的加入小牛血清或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，包括以下步骤：（１）培养来自细胞系的细胞；（２）在细胞长成致密单层时，接种脊髓灰质炎病毒减毒株病毒；（３）病毒在细胞中增殖；（４）收集细胞所产生的病毒悬液；（５）通过 澄清过滤去除细胞残渣；（６）通过凝胶过滤层析步骤和一个离子交换层析步骤纯化病毒液；（７）通过灭活剂灭活病毒；　（８）配制灭活病毒悬液。

【技术特征摘要】
1.一种制备脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，包括以下步骤(1)培养来自细胞系的细胞；(2)在细胞长成致密单层时，接种脊髓灰质炎病毒减毒株病毒；(3)病毒在细胞中增殖；(4)收集细胞所产生的病毒悬液；(5)通过澄清过滤去除细胞残渣；(6)通过凝胶过滤层析步骤和一个离子交换层析步骤纯化病毒液；(7)通过灭活剂灭活病毒；(8)配制灭活病毒悬液。2.权利要求1的方法，其中所述脊髓灰质炎病毒减毒株是脊髓灰质炎I、II、III型病毒减毒株，优选Sabin株、Sabin纯化株、中III2株或经批准的其他减毒株。3.权利要求1的方法，其中所述细胞是二倍体细胞系或Vero细胞。4.权利要求1的方法，其中所述脊髓灰质炎减毒病毒的感染复数为0.01-0.1。5.权利要求1的方法，其中所述细胞在含有微载体的发酵罐内培养或转瓶内培养。6.权利要求5的方法，其中所述微载体是cytodex1、cytodex2或cytopore。7.权利要求1的方法，其中在病毒接种后培养细胞48-120小时，然后收获培养上清液。8.权利要求1的方法，其中对收获的培养上清液进行1.2-0.22μ的滤器过滤，优选进行多个过滤步骤。9.权利要求1的方法，其中对经过过滤的培养上清液通过超滤进行浓缩，优选超滤膜的截留分子量为300KD以下，更优...

【专利技术属性】
技术研发人员：石慧颖，李懿，田龙，赵敏，翁捷，张冲，陈明，支惠，庞成华，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]