本发明专利技术提供了一种脊髓灰质炎灭活疫苗及其生产方法。所述的脊髓灰质炎灭活疫苗是应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产的，具体包括：在篮式生物反应器中加入M199培养基，接种Vero细胞培养，至长成致密单层后，用Earle's平衡盐溶液洗换；洗换结束后注入M199培养基液，接种脊髓灰质炎病毒，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；接种后培养42～72小时收获病毒液。本发明专利技术通过选择合适的培养基并控制适宜的培养温度、pH值、接种比例、溶氧等条件，病毒滴度高、抗原含量高，批间差异高度可控，质量均一。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是关于一种，具体是一种应用篮式生物 反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方法，以及利用该方法生产得到的 脊髓灰质炎灭活疫苗。
技术介绍
脊髓灰质炎（简称脊灰）是由脊髓灰质炎病毒感染所引起的、以肢体麻痹为主的 急性肠道传染病。脊髓灰质炎的主要易感人群为儿童。目前仍然没有有效的治疗脊灰的方 法，控制与消灭脊灰最重要的是有效的脊髓灰质炎疫苗。 国内外已应用的脊髓灰质炎疫苗有两种：口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（Oral poliovirus vaccine，0PV)和灭活脊髓灰质炎疫苗（Inactivated poliovirus vaccine， IPV)。其中，IPV不会产生疫苗相关麻搏型脊灰（Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis, VAPP)及疫苗衍生脊灰病毒（Vaccine-Derived Poliovirus, VDPV)引起 的脊髓灰质炎病毒循环iVDPV感染，且IPV可与其他疫苗联合使用；并且，由于OPV对于有 免疫缺陷的儿童会引起一定比例的脊髓灰质炎，WHO建议在全球证实消灭脊灰后尽早停止 OPV的使用。因此，对于IPV的研究迫在眉睫。 传统的灭活脊髓灰质炎疫苗是采用发酵罐或转瓶工艺生产，相关工艺可参见 CN1647822A、CN1297314C等，采用传统工艺，每批次的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，较 难控制，且存在劳动强度大、占地空间大、隐性污染引起高内毒素的隐患大、细胞生长环境 (温度、pH值、溶氧等）不易控制、细胞生长密度低等缺点。 近年来，利用生物反应器培养细胞的技术日趋成熟。目前已有关于以Sabin减毒 株作为生产用毒种、以Vero细胞的微载体生物反应器培养技术生产灭活疫苗的技术报道， 但该现有技术生产的疫苗安全性尚存在争议。CN102406928A公开了一种人二倍体细胞脊 髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，其中采用多级微载体生物反应器扩增传代培养人二倍体细 胞，每级生物反应器的细胞生长达到IO 6个/ml以上浓度时，消化细胞制备细胞悬液，按照 1 :10?1 :20的放大比例进入下一级的生物反应器进行扩增培养直至达到生产所需规模， 再接种脊髓灰质炎病毒、增殖培养、收获病毒培养液并进行纯化和灭活，但该技术生产的收 获液病毒滴度较低，且并没有公开具体的培养条件。 目前并未有应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产高质量脊髓灰质炎 灭活疫苗的技术报道。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质高效生产 高质量脊髓灰质炎灭活疫苗的方法。 为达到上述目的，本专利技术提供了一种应用篮式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰 质炎灭活疫苗的方法。事实上，以Vero细胞为基质接种脊髓灰质炎病毒的培养条件相对较 难控制。专利技术人经过反复摸索实验，最终确定了有利的细胞培养条件和脊髓灰质炎病毒繁 殖条件，成功地制备出了以Vero细胞为基质的脊髓灰质炎灭活疫苗，该疫苗具有良好的稳 定性。根据本专利技术所提供的应用篮式生物反应器制备Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方 法，其工艺步骤主要包括：细胞接种、洗换、病毒接种、病毒液收获。具体地，本专利技术的应用篮 式生物反应器生产Vero细胞脊髓灰质炎灭活疫苗的方法包括步骤 ： 在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养， 至长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换； 洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病 毒接种MOI为0. 01?0. 3,继续培养，病毒培养温度33±0. 5°C，溶氧40?80%，并控制病 毒培养阶段体系PH值为7. 4?7. 6 ; 病毒接种后培养42?72小时，收获病毒液。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法还包括： 收获的病毒液经适当稀释后配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后冻干，即为Vero细 胞脊髓灰质炎灭活疫苗制品。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，所述 脊髓灰质炎病毒为I型、II型、或III型脊髓灰质炎病毒。具体而言，I型脊髓灰质炎病毒 的收获时间为病毒接种后培养48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后 培养30-54小时，III脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养42-72小时。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，，控制 篮式反应器搅拌桨转速为：接种细胞阶段搅拌桨转速为110?130rpm ;培养细胞阶段转速 为70?90rpm ;接种病毒阶段转速为90?IlOrpm ;培养病毒阶段转速为70?90rpm。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，采用 篮式反应器控制系统的4Gas模式进行Vero细胞及病毒培养。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，所述 Vero细胞培养阶段中的生长液为高糖M199培养基，其初始葡萄糖含量为5. 0?6. Og/L ;在 Vero细胞培养过程中，当接种细胞40?60小时后，开启灌流生长液，并设定灌流量为2? 6L/day，维持细胞生长体系中的葡萄糖含量在2. 0?3. Og/L。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，Vero 细胞接种密度为：〇. 5X106?3. 0X106cells/ml ;培养体系pH 7. 4?7. 6,温度37土rc ; 培养6?8天至长成致密单层。 根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法中，是在 接种病毒后第42-72小时采取连续或半连续灌流病毒维持液的方式开启流加并进行病毒 液的连续收获，所述病毒维持液为M199培养基；病毒维持液的灌流量为2?6L/day，维持 病毒生长体系中的葡萄糖含量大于等于2. Og/L。 另一方面，本专利技术还提供了一种按照本专利技术所述的方法制备得到的Vero细胞脊 髓灰质炎灭活疫苗。 本专利技术的应用篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗的方 法中，未详细提及的步骤（例如，以所收获的病毒液经纯化、灭活和/或冻干等制备疫苗制 品的步骤）可以按照所属领域的常规操作进行（例如，根据北京天坛生物制品股份有限公 司或其他公司或文献记载的现有转瓶培养收获液进行相同的配制制备疫苗制品）；未详细 提及的反应器的操作方法及其他工艺参数可以参照反应器的说明书确定。本专利技术的关键在 于确定了对以篮式生物反应器以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫苗所得病毒收获 液有重要影响的因素条件：确定篮式反应器培养I、II、III型脊髓灰质炎病毒的培养基、PH 值、培养温度；病毒接种时间、病毒接种MOI ;溶氧条件；病毒收获时间等。通过控制这些因 素条件在本专利技术的范围内，能够成功地制备出以Vero细胞为基质生产脊髓灰质炎灭活疫 苗，所得病毒收获液在具有较高收获量的情况下具有较高的病毒滴度。 整体而言，本专利技术技术方案带来的有益效果：采用篮式反应器成功培养脊髓本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，该方法包括步骤：在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换；洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接种MOI为0.01～0.3，继续培养，病毒培养温度33±0.5℃，溶氧40～80％，并控制病毒培养阶段体系pH值为7.4～7.6；病毒接种后培养42～72小时，收获病毒液。
【技术特征摘要】
1. 一种脊髓灰质炎灭活疫苗的生产方法，该方法包括步骤： 在篮式生物反应器中加入M199培养基作为细胞生长液，接种Vero细胞进行培养，至长 成致密单层后，应用Earle's平衡盐溶液进行洗换； 洗换结束后注入M199培养基液作为细胞生长液，进行脊髓灰质炎病毒的接种，病毒接 种MOI为0. 01?0. 3,继续培养，病毒培养温度33±0. 5°C，溶氧40?80%，并控制病毒培 养阶段体系PH值为7. 4?7. 6 ; 病毒接种后培养42?72小时，收获病毒液。2. 根据权利要求1所述的方法，该方法还包括： 收获的病毒液经适当稀释后配制脊髓灰质炎灭活疫苗，配制后冻干，即为Vero细胞脊 髓灰质炎灭活疫苗制品。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述脊髓灰质炎病毒为I型、II型、或III 型脊髓灰质炎病毒。4. 根据权利要求3所述的方法，其中，I型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培 养48-66小时，II型脊髓灰质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养30-54小时，III脊髓灰 质炎病毒的收获时间为病毒接种后培养42-72小时。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，控制篮式反应器搅拌桨转速为： 接种细胞阶段搅拌桨转速为110?130rpm ;培养细胞阶...
【专利技术属性】
技术研发人员：王辉，赵玉秀，李爱灵，梁宏阳，刘小娟，赵硕，董圆，曾令冰，
申请(专利权)人：北京天坛生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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