提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法技术

一种生物技术领域的提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法，包括如下步骤：配制种子培养基和发酵培养基；将灵芝菌丝体接入种子培养基中，培养，得一级种子培养液；取一级种子培养液，接入种子培养基中，培养，得二级种子培养液；取二级种子培养液，接入发酵培养基中，培养，得发酵细胞；将发酵细胞置于静止培养器皿中，静止培养，在细胞生长对数期加入苯巴比妥或咪康唑，继续静止培养至收获期，收取上层细胞。本发明专利技术的方法使得灵芝菌丝体中总灵芝酸含量达到４１．４ｍｇ／ｇ干细胞，同时单体灵芝酸的含量也得到提高１５％～６０％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物
的方法，具体是一种提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法。
技术介绍
灵芝(Ganoderma lucid咖)为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌，作为一种 传统的中药已有数千年的应用历史。药理研究表明，灵芝有广泛的药理作用，如抗HIV病 毒，免疫调节，抗心肌缺血，调节血脂，降血糖，镇静作用，保肝作用，抗放射和抗化疗，抗缺 氧和抗衰老作用等。近代人们开始研究通过人工栽培和深层发酵技术，获得大量灵芝菌 丝体及其有效成分，为灵芝的药理学研究和产品开发提供了充足的原料。研究发现，灵芝 中的有效成分主要包括灵芝多糖和灵芝酸，灵芝酸等三萜类化合物是灵芝类的主要化学 成分之一。自1982年Kubota等人首次分离得到灵芝酸A， B类化合物以来，灵芝中已有 200多种三萜被分离出来，其中100多种是灵芝酸。研究表明，灵芝酸T具有诱导肺癌细 胞凋亡活性(Tang W. ， Liu J. -W. ， Zhao W. -M. ， Wei D. -Z. ， Zhong J. -J. Life Sciences, 80(2006)205 211.)，而灵芝酸Me具有抑制肿瘤扩散(N. H. Chen， J. W. Liu， J. J. Zhong. Journal ofPharmacological Sciences,108 (2008)212 216)和增强IL-2和IFN-y 表达以及增加NK细胞活性(G. Wang， J. Zhao， J. Liu， Y. Huang， J. -J. Zhong， W. Tang. InternationalImm皿opharmacology， 7 (2007) 864 870.)。 经对现有技术的文献检索发现，中国专利技术专利申请公开说明书CN1375557A披露 了如下内容钟建江和汤亚杰公开了生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方 法，可以高效率生产灵芝酸，产量1066mg/L，细胞内含量达5mg/100mg干重；中国专利技术专利 申请公开说明书CN1264743A披露了一种液体好氧发酵液体静置培养法生产灵芝酸的工 艺，使总灵芝酸的产量较一般液体好氧发酵法产量提高了 2. 3倍。但是，灵芝酸有较广泛的 药理活性，对灵芝酸的进一步研究将有利于灵芝中有效成分的寻找和进一步探索新的活性 并阐明其药理活性机制，灵芝酸在灵芝细胞中的含量一般很低，分离纯化也较难，这限制了 灵芝酸的活性及作用机理的研究及广泛应用。如何进一步提高灵芝酸的产量是目前急需解 决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高细胞中灵芝酸含量的灵芝 细胞培养方法。本专利技术使得灵芝菌丝体中总灵芝酸含量达到41.4mg/g干细胞，同时单体灵 芝酸的含量也得到提高15% 60%。 本专利技术是通过以下的技术方案实现的，本专利技术包括如下步骤 步骤一，配制种子培养基和发酵培养基； 所述种子培养基具体为，lL培养基由以下组分组成，葡萄糖35g，蛋白胨5g，酵母 粉2. 5g，磷酸二氢钾1. 0g， MgS04 7H20 0. 5g，维生素Bl 0. 05g，余量为水; 所述发酵培养基具体为，lL培养基由以下组分组成，乳糖35g，蛋白胨5g，酵母粉5g，磷酸二氢钾1. 0g， MgS04 7H20 0. 5g，维生素Bl 0. 05g，余量为水; 步骤二，将灵芝菌丝体接入种子培养基中，培养，得一级种子培养液； 步骤三，取一级种子培养液，接入种子培养基中，培养，得二级种子培养液； 步骤四，取二级种子培养液，接入发酵培养基中，培养，得发酵细胞； 步骤五，将发酵细胞置于静止培养器皿中，静止培养，加入苯巴比妥或咪康唑，继续静止培养至收获期，收取上层细胞。 步骤二中，所述培养为25 32°C、80 150rpm下培养3 8天。 步骤三和步骤四中，所述接入具体为按照体积比，培养液的接入量为培养基的10%。 步骤三和步骤四中，所述培养为25 32°C、80 150rpm下培养2 5天。 步骤五中，所述加入苯巴比妥具体为在静止培养的发酵细胞生长中期时，加入苯 巴比妥，使得苯巴比妥的终浓度为0. 01 1. OmM。 步骤五中，所述加入咪康唑具体为在静止培养的发酵细胞生长中后期时，加入咪 康唑，使得咪康唑的终浓度为0. 001 0. lmM。 本专利技术采用二阶段灵芝菌丝体培养方法(Fang Q. _H. ， Zhong， J.-J. Process Biochem2002 ;37 :769-74)，于静止培养期间往培养基中添加苯巴比妥或咪康唑，继续静止培养至结束，然后采用常规方法从发酵产物中提取收集灵芝酸并进行总灵芝酸含量和各单 体含量的测定(Tang Y. _J. ， et al. ， Enzyme Microb Technol 2002 ;31 :20_8 ;Tang，W. ， et al. ， Biochem Eng J 2006 ;32 :205-10)。 与现有技术相比，本专利技术具有如下优点本专利技术通过添加低浓度的苯巴比妥，使总 灵芝酸的最高含量达41. 4mg/g干细胞，比对照提高44% 。灵芝酸单体GA-Mk， GA_T， GA_S 和GA-Me的最大含量分别达到1118. 9， 2609. 2， 1231. 1，794. 7 y g/g干重，分别比对照提 高44%，39%，32%和55% ;添加咪康唑，总灵芝酸的含量为30. 4mg/g干细胞，比对照提高 15%，四个单体灵芝酸GA-Mk， GA-T， GA-S和GA-Me的含量分别达858. 0， 2136. 0， 1113. 0， 625. IP g/g干细胞，分别比对照提高11%， 10%，22%，28%。 本专利技术技术方案中涉及的灵芝(Ganoderma lucidum)CGMCC NO. 5616，可从中国微 生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)购得，中心地址北京市朝阳区霄云路32号。具体实施例方式本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过 程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1 步骤一， 配制种子培养基，所述种子培养基具体为，1L培养基由以下组分组成，葡萄糖 35g，蛋白胨5g，酵母粉2. 5g，磷酸二氢钾l.Og， MgS04*7H20 0. 5g，维生素Bl 0. 05g，余量 为水； 配制发酵培养基，所述发酵培养基具体为，lL培养基由以下组分组成，乳糖35g，4蛋白胨5g，酵母粉5g，磷酸二氢钾1.0g，MgS04 7H20 0. 5g，维生素Bl 0. 05g，余量为水； 配制0. 2M苯巴比妥溶液称取苯巴比妥0. 0464g，溶解于lml DMSO中。 步骤二，在250mL摇瓶中，将10mL灵芝(Ganoderma lucidum) CGMCC NO. 5616的菌丝体接入40mL种子培养基中，3(TC、120rpm下培养6天，得一级种子培养液； 步骤三，在250mL摇瓶中，将5mL —级种子培养液添加到45mL种子培养基中，30°C 、 120rpm下培养2天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高细胞中灵芝酸含量的灵芝细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤：　　　　步骤一，配制种子培养基和发酵培养基；　　　　步骤二，将灵芝菌丝体接入种子培养基中，培养，得一级种子培养液；　　　　步骤三，取一级种子培养液，接入种子培养基中，培养，得二级种子培养液；　　　　步骤四，取二级种子培养液，接入发酵培养基中，培养，得发酵细胞；　　　　步骤五，将发酵细胞置于静止培养器皿中，静止培养，加入苯巴比妥或咪康唑，继续静止培养至收获期，收取上层细胞；　　　　所述种子培养基为，１Ｌ培养基由以下组分组成，葡萄糖３５ｇ，蛋白胨５ｇ，酵母粉２．５ｇ，磷酸二氢钾１．０ｇ，ＭｇＳＯ４.７Ｈ２Ｏ　　０．５ｇ，维生素Ｂ１　　０．０５ｇ，余量为水；　　　　所述发酵培养基为，１Ｌ培养基由以下组分组成，乳糖３５ｇ，蛋白胨５ｇ，酵母粉５ｇ，磷酸二氢钾１．０ｇ，ＭｇＳＯ４.７Ｈ２Ｏ　　０．５ｇ，维生素Ｂ１　　０．０５ｇ，余量为水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟建江，梁翠霞，李英波，王家乐，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]