氨基酸诊断／测定试剂（盒）及氨基酸的浓度测定方法技术

本发明专利技术涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的氨基酸诊断／测定试剂（盒），同时本发明专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学／食品／环境检验测定技术领域。本发明专利技术的试剂（盒）主要成分包括：缓冲液、辅酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外／可见光分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ处吸光度上升的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本专利技术还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定

技术介绍
氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提出一种利用间接酶循环扩增法(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本专利技术还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本专利技术氨基酸浓度测定方法如下：氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+过氧化氢氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶K+  色氨酸+水色胺酸+辅酶色胺酸脱氢酶/Ca2+(吲哚-3-基)丙酮酸+氨+还原型辅酶这种方法应用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC 1.4.3.3)酶(偶)联色氨酸酶(tryptophanase；EC 4.1.99.1)、色氨酸脱氢酶(Tryptophandehydrogenase；EC 1.4.1.19)酶促反应连续监测法。氨基酸氧化酶及色氨酸酶作为作用酶，功能为将氨基酸酶解产生氨再生成色氨酸。色氨酸脱氢酶作为循环酶：色氨-->酸脱氢酶的酶促作用使色氨酸再次生成氨，使氨不断地被重复循环利用。色氨酸脱氢酶又作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算出氨基酸的浓度。钾离子及钙离子分别激活色氨酸酶及色氨酸脱氢酶活性。实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本专利技术氨基酸诊断/测定试剂(盒)较为理想：缓冲液        100mmol/L稳定剂        500mmol/L辅酶          3mmol/L氨基酸氧化酶  10000U/L色氨酸酶      12000U/L色氨酸脱氢酶  12000U/L丙酮酸        12mmol/L吲哚          6mmol/L氯化钾        5mmol/L氯化钙        4mmol/L本专利技术的氨基酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶。辅酶、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：试剂1缓冲液、稳定剂、辅酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙。试剂2缓冲液、稳定剂、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶。试剂3缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶。辅酶、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脱氢酶、丙酮酸、吲哚、氯化钾、氯化钙在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解-->后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。无论是单剂、双剂还是三剂，本专利技术测定氨基酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。具体实施方式下面结合实施例子对本专利技术作进一步的说明。实施例一本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂                        500mmol/L辅酶                          3mmol/L氨基酸氧化酶                  10000U/L色氨酸酶                      12000U/L色氨酸脱氢酶                  12000U/L丙酮酸                        12mmol/L吲哚      6mmol/L氯化钾    5mmol/L氯化钙    4mmol/L试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测氨基酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出氨基酸的浓度大小。实施例二本实施例的氨基酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：试剂1三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L稳定剂                        50mmol/L辅酶                          3mmol/L丙酮酸                        12mmol/L吲哚                          6mmol/L氯化钾                        5mmol/L氯化钙                        4mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100mmol/L稳定剂          50mmol/L氨基酸氧化酶    10000U/L-->色氨酸酶        12000U/L色氨酸脱氢酶    12000U/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法如下：　　氨基酸＋水＋氧氨基酸氧化酶氧代酸＋氨＋过氧化氢　　氨＋丙酮酸＋吲哚色氨酸酶／Ｋ↑［＋］色氨酸＋水　　色胺酸＋辅酶色胺酸脱氢酶／Ｃａ↑［２＋］（吲哚－３－基）丙酮酸＋氨＋还原型辅酶　　将最终反应物置于紫外／可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长３４０ｎｍ吸光度上升的速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。

【技术特征摘要】
1.一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的氨基酸的浓度测定方法，其方法如下：氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+过氧化氢氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶/K+色氨酸+水色胺酸+辅酶色胺酸脱氢酶/Ca2+(吲哚-3-基)丙酮酸+氨+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出氨基酸的浓度大小测定结果。2.一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：缓冲液                   20——500mmol/L稳定剂                   1——4000mmol/L辅酶                     1——6mmol/L氨基酸氧化酶             1000——80000U/L色氨酸酶                 1000——80000U/L色氨酸脱氢酶             1000——80000U/L丙酮酸                   1——50mmol/L吲哚                     1——50mmol/L氯化钾                   1——50mmol/L氯化钙                   1——50mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。3....

【专利技术属性】
技术研发人员：王尔中，
申请(专利权)人：苏州艾杰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]