戊型肝炎兔－人嵌合抗体质控物的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种戊型肝炎兔－人嵌合抗体质控物及其制备方法，属于临床检验学和生物技术领域。戊型肝炎兔－人嵌合抗体质控物，其特征在于：为兔抗人ＨＥＶ－ＩｇＧ和人ＩｇＭ嵌合抗体，以１－乙基－３［３－二甲基氨基丙基］碳二亚胺交联构成。本发明专利技术的创新点在于：本发明专利技术构建的用于免疫分析ＨＥＶ的嵌合抗体质控物适用于ＥＱＡ和ＩＱＣ。利用化学交联方法构建抗ＨＥＶ　ＩｇＭ质控物在国内外仍属首次。该质控物可在保持相对均一的前提下重复生产，相对稳定，易于高滴度大量获得，没有潜在的生物传染危险性，较为经济，不涉及医学伦理学问题，并且其与抗原的亲和力较高。是一种良好的阳性质控物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于特异IgM(抗-HEV)检测的兔-人嵌合抗体质控物及其制备方 法，属于临床检验学和生物

技术介绍
戊型肝炎病毒(h印atitis E virus, HEV)曾称为经消化道传播的非甲非乙型肝炎 病毒。1955年首次在印度暴发流行，当时认为是甲型肝炎病毒所致。70年初建立了HAV 的检测方法，重新对当时肝炎患者的血清进行检测，结果未发现患者血清中抗-HAVIgM 或IgG效价升高，因此确定为消化道传播的非甲非乙型肝炎病毒所致。1986年，我国新 疆南部地区发生戊型肝炎流行，约12万人发病，死亡700余人，是迄今世界上最大的 一次流行。1989年，Reyes等应用基因克隆技术，获得了该病毒基因组cDNA克隆，并正 式命名为戊型肝炎病毒。HEV病毒体呈球状，无包膜，平均直径为32 34nm，表面有锯齿状刻缺和突起，形 似杯状，故将其归类于杯状病毒科(Caliciviridae)。本病毒对高盐、氯化铯、氯仿等 敏感；在一70 8'C中易裂解，但在液氮中保存稳定。细胞培养未获成功；多种非人灵 长类动物可感染HEV。 HEV基因组为单正链RNA，全长约7. 5kb，具有polyA尾，共有3 个0RF，最长的第一个ORF约5kb，编码病毒复制所需的依赖RNA的RNA多聚酶等非结 构蛋白。第二个0RF长约2kb,含有编码病毒核衣壳的基因。第三个0RF只有300余个 核苷酸，与第一、二ORF有部分重叠。已知HEV有2个基因型，其代表株为缅甸株(B)和墨西哥株(M)。中国株与缅甸 株属同一型，两者的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93%和98%;墨西哥株属另 一型，其核苷酸和氨基酸序列与缅甸株的同源性分别为77%和89%。HEV主要经粪-口途径传播，潜伏期为10 60d，平均为40d。经胃肠道进入血液， 在肝内复制，经肝细胞释放到血液和胆汁中，然后经粪便排出体外。人感染后可表现为 临床型和亚临床型(成人中多见临床型)，病毒随粪便排出，污染水源、食物和周围环 境而发生传播。潜伏期末和急性期初的病人粪便排毒量最大，传染性最强，是本病的主 要传染源。HEV通过对肝细胞的直接损伤和免疫病理作用，引起肝细胞的炎症或坏死。临床上表现为急性戊型肝炎(包括急性黄疸型和无黄疸型)、重症肝炎以及胆汁淤滞性 肝炎。多数患者于发病后6周即好转并痊愈，不发展为慢性肝炎。孕妇感染HEV后病情 常较重，尤以怀孕6 9个月最为严重，常发生流产或死胎，病死率达10% 20%。对HEV的感染最好作病原学诊断，否则很难与甲型肝炎相区别。可用电镜或免疫电 镜技术检测患者粪便中的HEV病毒颗粒。尽管体外培养HEV方法已经取得一定进展，然 而病毒培养的周期长，故仍不适宜临床检测。虽然也可用RT-PCR法检测粪便或胆汁中 的HEVRNA，然而，病毒核酸仅在急性感染前期才可被检测出来，随着抗体滴度的增加， 病毒会迅速下降。目前，临床诊断常用的方法是检查血清中的抗-HEV IgM或IgG，如抗 -HEVIgM阳性，则可确诊患者受HEV感染；如血清中存在抗-HEV IgG，则不能排除是既 往感染；因为抗-HEV IgG在血中持续存在的时间可达数月至数年。IgMELISA常用于临 床检测HEV急性期感染。然而，抗-HEVIgM检测敏感性低，常常因为假阴性结果的发生而导致不准确性，为 了排除假阴性结果，在检测中需要阳性质控物作为对照，在检测中，只有阳性质控物的 检测结果正确，才能保证检测结果的可靠性。 一般来说，用于临床检验室的质控品需要 具备良好稳定性，预期结果已知，无已知的生物传染危险性和单批可大量获得等性质。 通常来说，用于抗-HEVIgM检测的质控物为来自于病人或者献血员的含有已知量抗-HEV IgM的血清或血浆与正常血浆或血清的混合物，使用此种阳性质控物有很多显而易见的 缺点，如价格较昂贵，可能存在医学伦理问题，有潜在的传染危险性，在存在IgG和IgM 的血清中PCR检测阳性率达51%。并且，因为抗-HEVIgM常出现在病毒感染的早期，既 急性期，在感染数月后抗体滴度将逐步衰退，通常来说，黄疸期出现的第26天，IgM 抗体检出率为73%， 1-4个月，检出率为50%， 6-7个月时则只有6%，第八个月时则完全 无法检出，这也增加了获得此类阳性质控物的难度，使其不能大量获得。为了克服传统质控物的上述缺点，人们不断寻求此类质控物的替代品。由鼠抗体 可变区和人抗体恒定区组成的基因工程嵌合抗体质控物因此发展起来，在某种程度上 克服了传统质控物的缺点。然而，此类质控物的制备涉及杂交瘤技术，重组DNA技术 等，较为复杂，延长了质控物的制备周期，并且此类抗体的亲和力较之真实的人类标 本低。
技术实现思路
本专利技术的要解决的第一个技术问题是提供一种戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供。 戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，为兔抗人HEV-lgG和人IgM嵌合抗体，以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺交联构成。 所述兔抗人HEV-lgG为多克隆抗体。所述人IgM为市售产品，来源于戊肝IgM病毒抗体诊断试剂盒，北京万泰生物药 业有限公司。，包括如下歩骤(1) 用HEV抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清；(2) 纯化兔抗人HEV-lgG;(3) 兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成嵌合抗体。所述用服V抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清是指采用皮内多点注射 免疫法，免疫新西兰大白兔，经一次基础免疫和多次加强免疫，得到含多抗的血清。所述纯化兔抗人HEV-lgG的方法是采用Amersham公司HiTrap protein A HP 纯化抗体。所述兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成嵌合抗体是指取纯化后的兔抗-HEVIgG 和IgM适量，在MES交联缓冲液中交联，PBS透析去除小分子，即得。在本研究中，我们拟用一种化学交联方法建立的兔抗HEV-lgG和人IgM嵌合抗 体替代传统的血清作为质控物。利用EDC (l-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺) 作为此两种抗体的交联剂形成嵌合抗体，因为兔抗-HEV IgG可与商品试剂盒中标记 了酶的抗原结合，人IgM能与试剂盒中包被在微孔板上的特异识别人IgM Fc片段 的抗人p链结合，故此嵌合抗体可用于抗-HEV IgM检测的质控物。临床诊断HEV常用的方法是检査血清中的抗-HEVIgM，如抗-HEVIgM阳性，则基本 可确诊患者受HEV感染。为了避免检测中假阴性结果的出现，确保检测结果的可靠性， 需要一种含有的HEV抗体的阳性质控物。检测中使用阳性质控作为对照，虽然不能增加 检测灵敏性，但是可以提供信息帮助发现检测中可能存在的问题，提高HEV筛查过程 的总体质量。在本研究中，我们采用化学的方法将兔抗-HEV IgG和人-IgM交联在一起得到嵌合 抗体，可用于免疫分析中HEV检测的阳性质控物。首先我们通过用HEV基因重组抗原 免疫家兔，获得的兔抗-HEV IgG多克隆抗体经过蛋白A-Sepharose亲和层析的方法加 以纯化。兔抗-HEV多克隆抗体被纯化以后，我们用SDS-PAGE蛋白电泳分析其纯度和用紫外分析仪测定其260nm和280nm吸光度计算抗体浓度。实验结果表明本文档来自技高网...

【技术保护点】
戊型肝炎兔－人嵌合抗体质控物，其特征在于：为兔抗人ＨＥＶ－ＩｇＧ和人ＩｇＭ嵌合抗体，以１－乙基－３［３－二甲基氨基丙基］碳二亚胺交联构成。

【技术特征摘要】
1.戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于为兔抗人HEV-IgG和人IgM嵌合抗体，以1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺交联构成。2. 根据权利要求1所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于所述兔 抗人HEV-lgG为多克隆抗体。3. 根据权利要求l所述的戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物，其特征在于所述人 IgM为市售产品。4. 戊型肝炎兔-人嵌合抗体质控物的制备方法，包括如下步骤(1) 用HEV抗原免疫新西兰大白兔，得到含多抗的血清；(2) 纯化兔抗人HEV-lgG;(3) 兔抗人HEV-lgG和人IgM交联形成...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金明，张括，王露楠，张瑞，
申请(专利权)人：卫生部北京医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]