一种乙型肝炎病毒表面抗原的磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法技术

技术编号:4095198 阅读:287 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术提供了乙型肝炎病毒表面抗原的体外检测方法,该方法采用了磁微粒分离化学发光免疫分析技术,它是酶标记技术、磁微粒分离技术和化学发光检测技术相结合的产物,兼具灵敏度高、特异性好、重复性好等特点。可用于人血清、血浆中乙肝表面抗原含量的测定,临床上该指标多用于判断是否感染过乙肝病毒,主要用于监测乙型肝炎的病情及治疗效果和预后。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫检测分析
,涉及到临床判定乙型肝炎病毒感染的一项诊 断指标乙型肝炎病毒表面抗原,提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原的磁分离化学发光免疫 检测方法,适用于人血清、血浆乙型肝炎病毒表面抗原的定量检测。
技术介绍
乙型肝炎又称为血清性肝炎、乙型病毒性肝炎(简称乙肝),是由乙型肝炎病毒 (Hepatitis B Virus,HBV)引起的传染病。通过血液与体液传播,具有慢性携带状态。乙 肝临床表现多样化,易发展为慢性肝炎和肝硬化,一些病人可转变为原发性肝癌。乙型肝炎病毒表面抗原(HBs-Ag)是乙肝病毒的血清学标志物之一,该蛋白由S基 因编码,有“a”、“b”、“y”、“r”、“w”等多种抗原决定簇,其中“a”是共同的抗原决定簇,“d”、 “y”和“r”、“w”为主要的亚型决定簇。HBs-Ag主要有adr,adw, ayr,及ayw等4种亚型。 HBs-Ag是急性感染时最早出现的血清学标志。该抗原常常在症状出现前1-6周就可检测 到,免疫力正常的机体会产生表面抗体,该抗体可以中和病毒,是一种保护性抗体。HBs-Ag 检测阳性是病毒活跃的标志,通常意味着患者具有传染性;阴性的情况要么是病人从未感 染,要么是感染后已经康复或者隐匿性感染。症状出现后4个月,免疫力正常个体可以清除 HBs-Ag,机体开始康复,在康复期HBs-Ag表现为阴性,但是,有些人尤其是婴幼儿或免疫力 差的个体(如艾滋病患者),会形成慢性乙肝病毒感染,HBs-Ag会持续阳性。乙型肝炎的流行性监测通常以检测HBs-Ag作为标准,急性感染时,HBs-Ag可在感 染后4周左右检测到,还常常伴有一定的临床症状;而慢性感染则通常以HBs-Ag阳性6个 月以上为诊断标准。作为一种血清学标志物,HBs-Ag不仅用在诊断上,也用于筛查捐献的 血液。临床上对乙型肝炎病毒表面抗原的检测主要是采用免疫学方法。临床免疫检测技 术是利用抗原抗体反应原理检测生物体内物质的技术,该技术的引入使临床化学检验发生 了革命性的变化检测项目不断增加,方法的灵敏度更高、特异性更强,自动化程度更高。自 上世纪80年代以后,免疫学检测技术随着单克隆抗体、人工合成多肽、基因工程表达抗原 及各种标记技术的成熟而迅速发展,放射免疫测定(RIA)和酶免疫测定(EIA)逐渐取代传 统的免疫沉淀和免疫凝聚,使检测的敏感性、特异性都大大提高,随后化学发光技术的应用 使免疫学检测的敏感性和线性范围得到进一步的提高。这些技术在临床检验中的应用为疾 病的定量检测、疗效观察及病因探讨提供了更直接和客观的资料。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有灵敏度高、特异性好、适用性广的检测乙型肝炎 病毒表面抗原的磁微粒分离化学发光免疫检测方法。本专利技术生成的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分离化学发光免疫的试剂盒组成包括①定标液(含一定浓度的乙型肝炎病毒表面抗原,用于确定CutOff值);②乙型肝炎病 毒表面抗原阴、阳对照品(阳性对照含一定浓度的乙型肝炎病毒表面抗原,用于检验的结 果的质量控制);③乙型肝炎病毒表面抗原抗试剂1号、2号(偶联有生物酶的乙型肝炎病 毒表面抗原的抗体和偶联有FITC的乙型肝炎病毒表面抗原的抗体);④磁分离试剂(结合 抗FITC的磁微粒混悬液);⑤清洗液浓缩液(用于配制清洗液);⑥底物溶液(生物酶催化 的发光底物)。所述的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分离化学发光免疫检测方法的检测步骤如 下(1)加样与免疫反应在试管中加入5_100yL处理好的样本、定标液和对照品,然 后分别加入10-500 μ L乙型肝炎病毒表面抗原抗试剂1号和2号,混勻,37°C温育5_60分 钟;(2)免疫复合物与磁微粒结合向试管中加入20-100 μ L磁分离试剂,混勻,37°C 温育0-30分钟(也可不温育);(3)磁分离与洗涤使磁微粒在磁场中沉降,去除上清;加入100-600μ L清洗液, 去除磁场,震荡使磁微粒充分混悬,然后再次使磁微粒在磁场中沉降,去除上清;可再加入 洗液清洗多次(也可省去);(4)加底物溶液并读出样本浓度每管加入50-300 μ L生物酶催化的发光底物,酶 促底物发光,根据样本的发光值和Cut Off值读出样本中乙肝表面抗原的S/C0值,判定样 本阴阳性。所述的乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分离化学发光免疫检测方法的工作原理是: 首先,待检样本与酶标记抗体、FITC标记抗体特异性结合形成“三明治”结构的夹心复合物, 夹心复合物再与磁微粒特异性结合(通过抗体上偶联的FITC与磁微粒上的抗FITC结合); 经过洗涤,结合物通过外加磁场被留下,未结合的抗原、抗体和其他物质被去除;加入底物, 用化学发光分析仪检测其发光值。在一定浓度范围内,待测样本中的乙型肝炎病毒表面抗 原浓度与发光值成正比,最后根据样本的发光值和Cut Off值读出样本中乙肝表面抗原的 S/C0值,判定样本阴阳性。本专利技术的技术解决方案如下(1)磁分离试剂的制备将FITC抗体连接在磁微粒表面。所述的磁微粒直径在 0.01-5.0μπι之间,具有超顺磁性,表面含有氨基(ΝΗ2-)或羧基(C00H-)活性基团。所述的 FITC抗体与磁微粒可以通过化学交联剂,如戊二醛、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbo diimide hydrochloride (EDC)等以共价键的形式,也可以通过物理吸附(静电作用、 离子键或疏水作用等)的形式进行偶联。(2)乙型肝炎病毒表面抗原抗试剂中酶标抗体的制备将生物酶与乙型肝炎病毒 表面抗原的抗体偶联,所述的生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP),也可以是碱性磷酸酶 (ALP)。偶联方法可以是过碘酸钠氧化法、戊二醛法或SuCCinimidyl4-(N-maleimid0methy 1) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交联等多种方法。(3)底物溶液所述的底物溶液可以是HRP催化的发光底物鲁米诺(Luminol),也 可以是ALP催化的发光底物AMPPD,CSPD和CSPD-Star等。(4)定标液和对照品选取经灭活的人血清,将其混合后用稀释液按一定比例稀4释而成。 附图说明图1为本专利技术试剂盒与国外知名公司进口 HBsAg化学发光试剂临床样本测试的一 致性。具体实施例方式实施例1 抗FITC抗原与表面氨基(C00H-)磁微粒偶联,制备磁分离试剂取IOOmg表面含羧基(C00H-)活性基团的磁微粒用0. IM MES(2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid),pH 4. 5-5溶液IOml洗涤3次。磁微粒用该溶液Iml重悬,加入 2mg抗FITC抗体,混合均勻。加入100 μ 1 10mg/ml EDC溶液,混合均勻后室温反应2小时。 用IOml含牛血清白蛋白(BSA)的0.0IM磷酸盐缓冲液(PBS)pH7. 4洗涤磁珠3次后,用 该溶液配制成2. 5mg/ml的磁分离试剂工作液。实施例2 碱性磷酸酶(ALP)与乙型肝炎病毒表面抗原的抗体的偶联取5mg乙型肝炎病毒表面抗原的抗体,浓缩至5mg/ml,加入13. 76mg/mL的活化剂本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
一种乙型肝炎病毒表面抗原磁微粒分离化学发光免疫分析检测方法,其特征在于结合了酶标记技术、磁微粒分离技术和化学发光检测技术,并生成了检测试剂盒。2.根据权利要求1所述的酶标记技术,其特征在于生物酶标记乙肝表抗原的抗体的方 法如下所述的生物酶可以是辣根过氧化物酶(HRP),也可以是碱性磷酸酶(ALP)。偶 联方法可以是过碘酸钠氧化法、戊二醛法或Succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-l-carboxylate (SMCC)、2-Iminothiolane · HCl (2IT)交联等多种方法。3.根据权利要求1所述的磁分离技术,其特征在于磁分离试剂的制备方法如下将FITC抗体连接在磁微粒表面。所述的磁微粒直径在0. 01-5. 0 μ m之间,具有超 顺磁性,表面含有氨基(NH2-)或羧基(C00H-)活性基团。所述的FITC抗体与磁微粒 可以通过化学交联剂,如戊 二酸、l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride (EDC)等以共价键的形式,也可以通过物理吸附(静电作用、离子键或疏水 作用等)的形式进行偶联。4.根据权利要求1所述的化学发光发光检测技术,其特征在于化学发光所用的底物 溶液可以是HRP催化的发光底物鲁米诺(Lumino...

【专利技术属性】
技术研发人员:郭健夫朱世伟王佳昳仝文斌
申请(专利权)人:北京倍爱康生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:11

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