人源化抗－ＮＧＦ抗体制造技术

人源化抗－ＮＧＦ抗体或保持与ＮＧＦ的结合活性的其片段，其中所述人源化抗－ＮＧＦ抗体包含：（ａ）ＶＨ区，其具有包含氨基酸序列ＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮＷ的第一ＣＤＲ、包含氨基酸序列ＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳ的第二ＣＤＲ、及包含氨基酸序列ＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡ的第三ＣＤＲ，和（ｂ）ＶＬ区，其具有包含氨基酸序列ＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡ的第一ＣＤＲ、包含氨基酸序列ＨＴ的第二ＣＤＲ、及包含氨基酸序列ＱＨＹＦＨＹＰＲＴ的第三ＣＤＲ。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种通过确定和比较三维结构的方式进行抗体人源化的方法，由此获 得的人源化抗体及其在体内治疗和诊断中的用途。
技术介绍
在人类中动物来源的单克隆抗体的治疗性和诊断性应用具有基本禁忌征候，特别 是对于必需重复给药的治疗方案。具体地，鼠单克隆抗体具有相对短的半衰期，并且当用于 人类时，缺乏一些免疫球蛋白的基本功能特性，如补体依赖性细胞毒性和细胞介导的细胞毒性。 另外，如果注射入患者体内的话，非人源的单克隆抗体包含免疫原性氨基酸序列。 许多研究显示在注射外源抗体后，受试者产生针对抗体本身的相当强烈的免疫反应(称为 HAMA-人抗鼠抗体_反应)，形成免疫复合物，药物动力学改变，产生变应性反应等，完全消 除了它的治疗性用途。而且，考虑到在小鼠或在其它哺乳动物中为了不同病状的治疗而开 发出来的不同单克隆抗体(因而对于人具有抗原性)的生长数目，由于交叉反应性，也是为 了不相关疗法而进行的治疗可以是无效的或者甚至是危险的。尽管所谓嵌合性抗体(可变 的鼠区域连接到人源的恒定区)的生产已经产生了一些阳性结果，但仍然余留着显著的免 疫原性问题。 在人类治疗性应用领域人源化抗体相对于动物源的抗体具有至少三种潜在的优 点。第一，人源的效应区，能够更好地与人免疫系统的其它部分相互作用，通过补体依赖性 细胞毒性，或细胞介导的抗体依赖性细胞毒性更加有效地破坏靶细胞。而且，人免疫系统并 不将人源化抗体的构架或恒定区(C)识别为外源性的，因此相对于针对鼠抗体(完全是外 来的)的抗体反应和相对于由嵌合性抗体(部分外来的)诱导的反应，针对人源化抗体的 抗体反应得以最小化。 已经报道了注射入人体内的鼠抗体比正常抗体具有短得多的半衰期(Shaw等， 1987)。人源化的抗体与天然人抗体具有非常相似的半衰期，这样就允许更少次数的给药和 更低的剂量。 人源化作用的基本原理为改变抗原识别，即CDR结构域，在人免疫球蛋白的环境 中的特异性("CDR移植"，Winter和Milstein)。已经报道了人源化抗体的几个例子，其 是为了试图解决免疫原性的问题而生产的(Maeda等，1991 ;Singer等，1993 ;T卿est等，1994 ;Kettleborough等，1991 ;Hsiao等，1994 ;Baca等，1997 ;Leger等，1997 ;Ellis等，1995 ;Sato等，1994 ;Jones等，1986 ;Benhar等，1994 ;Sha and Xiang， 1994 ;Shearman等， 1991 ;Rosok等，1996 ;Gussow &Seemann， 1991 ;Couto等，1994 ;Kashmiri等，1995 ;Baker 等，1994 ;Riechmann等，1988 ;Gorman等，1991 ;Verhoeyen等，1988 ;Foote &Winter， 1992 ;Lewis & Crowe， 1991 ;Co等，1991 ;Co等，1991 ;Verhoeyen等，1991 ;Eigenbrot等，1994 ;Hamilton等，1997 ;T卿est等，1995 ;Verhoeyen等，1993 ;Cook等，1996 ;Poul等，1995 ;Co等，1992 ;Graziano等，1995 ;Presta等，1993 ;Hakimi等，1993 ;Roguska等，1996 ;Adair等，1994;Sato等，1993 ;Tempest等，1991 ;Sato等，1996 ;Kolbinger等，1993 ;Zhu和Carter, 1995 ;Sims等，1993 ;Routledge等，1991 ;Roguska等，1994 ;Queen等，1989 ;Carter等，1992)。 由动物( 一般是鼠)到人源化的抗体的转录必需在相反的需求之间妥协，其解决方法根据情况而改变。为了使免疫原性最小化，免疫球蛋白将保持尽可能多的可接受的人序列。在任何情况下，为了保持最初的结合特性，免疫球蛋白构架在可接受的人序列中应当包含足够数目的突变以保证CDR区的构象尽可能与供体鼠免疫球蛋白的CDR区的构象相似。作为这些对立考虑的结果，相对于相应的鼠抗体对于许多人源化抗体已经报道了结合亲和性的显著丧失(Jones等，1986 ;Shearman等，1991 ;Kettleborough， 1991 ;German等，1991 ;Riechmann等，1988)。 当前，生产人源化免疫球蛋白的最普遍的方法是基于使用适合的基因组、合成序列，以及cDNA(Reichmann等，1988)。 专利申请EP 592106公开了由啮齿动物进行抗体人源化的方法。该方法是基于暴露于待人源化抗体的三维结构的表面上的氨基酸残基的鉴定，基于对应人抗体相同位置上氨基酸残基的鉴定，和基于用在人抗体中鉴定的残基替代啮齿动物抗体序列中鉴定的残基。
技术实现思路
本专利技术的作者建立了以一致性基于结构数据的途径，获得在人体中基本上无免疫原性的优化的人源化形式免疫球蛋白的方法，所述结构数据是通过实验获得的，其来自结晶学研究。本专利技术的方法允许以适合于治疗性制剂并且适合于其它医学和诊断应用的形式获得抗体。 本专利技术涉及一种充分建立在结构数据上的进行人源化第一设计阶段(通常更易出现误差)的方法。人源化免疫球蛋白具有在轻链和重链之间的两对异源二聚体，其中至少一条链具有一种或多种动物来源的CDRs，功能性结合到人来源的构架区片段上。例如，将动物来源的CDRs，与也是动物来源的天然相关联的氨基酸残基一起，导入人来源的构架区，以产生能够结合各自抗原的人源化免疫球蛋白，其具有与动物来源的原始免疫球蛋白相当的亲和力。 本专利技术的方法导致获得适于治疗性和诊断性应用的人源化抗体。具体地，获得了人源化的免疫球蛋白，其源自能够分别以高度特异性结合TrkA和NGF的抗TrkA抗体(专利EP1181318)和抗NGF抗体，压制配体和接纳体之间的相互作用。这些分子可用于治疗依赖于NGF/TrkA的肿瘤，慢性疼痛和炎性形式，并且可用于诊断目的，用于体内成像，例如，对TrkA阳性肿瘤进行成像，或对基底前脑进行成像作为阿尔茨海默氏病的早期标记。具体地，人源化的抗TrkA抗体在尿道和骨盆区的炎性形式中发现有特异性的治疗性和诊断性应用。具体地，人源化的抗NGF抗体在由HIV病毒诱导的病状中发现有特异性的治疗性和诊断性应用，以诱导免疫细胞，如HIV感染的NGF依赖性巨噬细胞的凋亡。 所以，本专利技术的目的是提供已知序列的动物抗体的VH和VL可变区的人源化的方法，包括以下步骤 a)如果不是现有的话，获得动物抗体的VH和VL区的结晶学结构； b)基于和所述动物抗体构架一级序列最高水平的同源性和同一性，预选一系列0-n个人来源或人源化抗体的可能的构架接纳体，以不小于3人的分辨率对其结构进行实验性测定； c)分别进行动物抗体的VH和VL可变区与b)中获得的VH和VL区之间的结构比较，并且计算每次比较的RMS，以鉴定具有较小RMS的人来源的VH区和VL区； d)将所述动物抗体的CDR区的序列插入于c)中鉴定的人序列中的合适位置； e)如果必要的话，将c)中鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源化抗－ＮＧＦ抗体或保持与ＮＧＦ的结合活性的其片段，其中所述人源化抗－ＮＧＦ抗体包含：　　（ａ）ＶＨ区，其具有　　包含氨基酸序列ＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮＷ的第一ＣＤＲ、　　包含氨基酸序列ＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳ的第二ＣＤＲ、及　　包含氨基酸序列ＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡ的第三ＣＤＲ，和　　（ｂ）ＶＬ区，其具有　　包含氨基酸序列ＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡ的第一ＣＤＲ、　　包含氨基酸序列ＨＴ的第二ＣＤＲ、及　　包含氨基酸序列ＱＨＹＦＨＹＰＲＴ的第三ＣＤＲ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A卡特尼奥，S科瓦瑟斯扎克，D拉姆巴，
申请(专利权)人：雷莱恩基因组股份公司，阿万扎蒂西萨国际高级学院，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]