一种ＴＮＦＲ－Ｆｃ融合蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及了一种新的重组ＴＮＦＲ－Ｆｃ融合蛋白及其用途。本发明专利技术利用分子生物学、细胞生物学和免疫学技术，构建了人ＴＮＦα受体的可溶片段与人ＩｇＧ２的Ｆｃ片段的融合蛋白，可用于ＴＮＦα异常活化相关疾病的预防或治疗。所述的融合蛋白具有极其优异的结合ＴＮＦα的效果，且稳定性好、半衰期长、副作用低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种新的重组TNFR-Fc融合蛋白及其用途。
技术介绍
人肿瘤坏死因子(hTNF-a )主要是由一种活化的单核/巨噬细胞产生的细胞因子，这是一种具有多种生物学效应的细胞因子，早期研究发现TNF- a能诱导肿瘤细胞坏死或凋亡，但后来发现TNF-a是介导炎症反应的主要细胞因子，也是引起发热和败血症休克的重要因素，在心衰、移植排斥反应和自身免疫疾病中起重要作用。适量的TNF-a能激活免疫系统、增强免疫力，在宿主抵抗微生物入侵和抑制肿瘤产生的防御系统中起着关键作用。但过量的TNF-a表达时，可以与其它炎性因子一起产生多种病理损伤。因此，TNF-a在体内起着双刃剑的作用。 人们已在多种疾病的研究中证实了 TNF-a的水平明显比正常人高，并发现其可能的致病机理(Feldman M， et al. ， Ann Rev Immunol 1996 ; 14 :397)。由于TNF-a参与了多种疾病的发生和发展过程，在某些疾病中起关键作用，在某些疾病中与其它因素共同作用；因此在不同水平上阻断TNF-a的作用，有可能对与TNF_ a有关的疾病产生治疗作用。目前以TNF-a为靶标的治疗疾病，有的已经获准临床使用，获得了预期的效果，有的正在进行临床实验。 细胞表面存在两种不同的TNFR，即分子量分别为55KD的TNFRI (CD120 a )和75KD的TNFRI I (CD120 P )。人TNF- a与TNFR的亲和力较高，与TNFRI和TNFRI I的亲和常数分别为1. 23±0. 23nM和0. 36±0. 13nM。两型TNFR的膜外区均可脱落，仍然保留结合TNF-a的活性。将受体的膜外区与抗体的Fc段连接，形成的融合蛋白则既可与TNF-a结合，又增加了稳定性，而且通过Fc段可形成二聚体，比天然出现的单体受体对TNF-a有更大的亲和力。 现有技术中，美国Immunex公司开发出了商品化的TNFRII_IgGl/Fc融合蛋白，称为Etanerc印t，商品名为Enbrel，已被FDA批准上市，用于治疗类风湿性关节炎、强直性脊椎炎和抑制银屑病病人的骨和关节损伤。然而，包含Enbrel在内的多种上市的TNF分子拮抗药物，由于这些药物具有诱导体内ADCC和CDC作用的可能(Tracey D，et al. ，PharmacolTher. 2008 ;117(2) :244-79)，因此这些药物都存在一定的副作用。 然而，目前发现的结合TNFa的制剂还存在结合能力较低，生物活性不高，体内有效作用时间短的缺陷，因此本领域有必要进一步研究改进的药物，以有效地提高药物疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子II型受体(TNFR II)可溶片段；羧基端是人IgG2的Fc片段。 本专利技术的另一 目的在于提供所述的融合蛋白的用途及组合物。 在本专利技术的第一方面，提供一种融合蛋白，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子II型受体(TNFR II)可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白2(IgG2)的Fc片段。 在另一优选例中，所述的融合蛋白在体内的半衰期高于48小时。 在另一优选例中，所述的人肿瘤坏死因子II型受体具有SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列。较佳的，所述的人n型TNFa受体可溶片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:l所示。 在另一优选例中，所述的人IgG2的Fc片段具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。较佳的，所述的人IgG2的Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。 在本专利技术的第二方面，提供一种核酸分子，所述的核酸分子编码所述的融合蛋白。 在另一优选例中，所述的核酸分子具有SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。 在本专利技术的第三方面，提供一种载体，它含有所述的核酸分子。 在另一优选例中，所述的载体中还可操作性地连接有谷氨酰胺合成酶(GS)的编码基因。 在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。 在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的编码基因序列如SEQ ID N0:5所示(或序列信息如Genebank X03495)。 在另一优选例中，所述的载体是pIRES双顺反子表达载体。 在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶的编码基因序列位于该表达载体的多克隆位点B ;上述的核酸分子位于该表达载体的多克隆位点A。 在本专利技术的第四方面，提供一种基因工程化的细胞， 所述的细胞含有所述的载体； 或所述的细胞基因组中整合有所述的核酸分子。 在本专利技术的第五方面，提供一种产生所述的融合蛋白的方法，所述的方法包括在适合表达所述融合蛋白的条件下，培养所述的宿主细胞，表达和分离出所述的融合蛋白。 在本专利技术的第六方面，提供所述的融合蛋白的用途，用于制备特异性结合肿瘤坏死因子a的组合物。 在另一优选例中，所述的组合物用于预防或治疗肿瘤坏死因子a异常活化相关疾病。 在另一优选例中，所述的肿瘤坏死因子a异常活化相关疾病包括类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、银屑病、败血症、哮喘、中风、糖尿病、Crohn' s病。 在本专利技术的第七方面，提供一种特异性结合肿瘤坏死因子a的组合物，所述的组合物含有 (i)有效量的所述的融合蛋白；禾口 (ii)药学上可接受的载体。 本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明 图1.重组质粒的酶切鉴定结果。其中，泳道1为DL250bp Marker ;泳道2为PCR验证重组质粒；泳道3为双酶切鉴定重组质粒；泳道4为DL500 15， OOObp的Marker。 图2.利用TNFR-IgG2Fc标准品制备的ELISA标准曲线。 图3.利用分离介质rProtein A S印harose 4Fast Flow禾口Q S印harose FF进行亲和层析和离子交换层析，纯化表达蛋白。图4.纯化后的蛋白的SDS-PAGE检测。其中，泳道l.蛋白标记；泳道2.非还原样^^ (211p080723-2);泳道3.非还原样品(211p080723-3);泳道4.非还原样^『(211p080723-4);泳道5.非还原样品(Enbrel);泳道6.蛋白标记泳道7.还原样品(Enbrel);泳道8.还原样品(211p080723-2);泳道9.还原样品(211p080723-3);泳道10.还原样^k (211p080723-4)。图5.纯化后的蛋白的western印迹检;则。其中，泳道l.蛋白标记；泳道2.非还原样^^ (211p080723-2);泳道3.非还原样品(211p080723-3);泳道4.非还原样^『(211p080723-4);泳道5.非还原样品(Enbrel);泳道6.蛋白标记泳道7.还原样品(Enbrel);泳道8.还原样品(211p080723-2);泳道9.还原样品(211p080723-3);泳道10.还原样^k (211p080723-4)。图6.TNFa体外毒性结合实验的原始结果。具体实施例方式本专利技术人经过深入的研究，意外地发现将人肿瘤坏死因子II型受体(TNFRII)可溶片段与人IgG2的Fc片段相融合，获得的融合蛋白具有极其优异的结合TNFa的效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白２的Ｆｃ片段。

【技术特征摘要】
一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基端是人肿瘤坏死因子II型受体可溶片段；羧基端是人免疫球蛋白2的Fc片段。2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的人肿瘤坏死因子II型受体可溶片段具有SEQ ID NO:l所示的氨基酸序列。3. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的人免疫球蛋白2的Fc片段具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。4. 一种核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子编码权利要求l-3任一所述的融合蛋白。5. 如权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子具有SEQID N0:3所示的核苷酸序列。6. —种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的核酸分子。7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的载体中还可操作性地连接有谷氨酰胺合成酶的编码基因。8. 如权利要求7所述的载体，其特征在于，所述的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱晖，王威，徐翠云，
申请(专利权)人：欣润上海生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]