一种具有６±１个ＰＥＧ链的血红蛋白分子（Ｈｂ），其中所述ＰＥＧ链中的２个结合到Ｈｂ的Ｃｙｓ－９３（β）上，其余ＰＥＧ链结合到引入到Ｈｂ的ε－氨基上的巯基上。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
血红蛋白(Hb)是红细胞的主要组成，红细胞携带氧从肺贯穿全身。当包含在红细胞中时，Hb以两个氧连接的αβ二聚物组成的四聚体结构存在，每个二聚物的分子量大约为32Kd。每个二聚物的每个α和β亚基都具有蛋白链和血红素分子。α和β蛋白链的序列是已知的。Hb是一种用于输血的可能有用的血液代用品，而且已经提出用作感染性休克中捕捉氧化亚氮，以及在癌症的放射治疗中调节组织的氧合作用的试剂。重组DNA技术能生产修饰的Hb，其具有调节用于个别治疗应用的特殊需要的氧亲和力。无细胞Hb的血管活性，即小动脉和毛细血管的收缩作用，当灌输纯化的无细胞Hb溶液，或分子内交联的Hb时，已经成为开发基于Hb的载氧体的主要障碍(Savitzsky等人1978，Sloan等人1999，Saxena等人1999)。该血管活性归因于Hb的NO清除作用(Doharty等人1998)。两种分子方法，二者之间截然不同，企图用于克服Hb的NO清除活性。第一种方法是重组DNA方法，其试图通过远端的血红素袋的位点特异性诱变来修饰Hb的NO结合活性，从而降低Hb的氧化亚氮清除活性(Eich et al，1996)。第二种方法是化学方法，其中通过低聚化作用来增加Hb的分子大小，低聚化作用将降低或可能完全抑制Hb从血管空间外渗到胞间隙(Hess等人1978，Thomas等人1993，Muldoon等人1996，Macdonal等人1994，Furchgott 1984，Kilbourn等人1994)。但是只有当Hb的血管活性主要作为外渗的结果而介导时，增加分子大小的方法才是成功的。虽然低聚化介导的Hb大小增加显示出Hb血管活性有所降低，但是通过重组DNA技术，或通过包括Hb的低聚化作用使用小分子双功能试剂来进行大小增加的方法，都没有产生不致高血压的Hb溶液。一个例外是Hb的低聚化产物(Matheson等人2002)，其分子大小远远超过300kDa，平均分子半径为24nm，发现其是不致高血压的而且不外渗。但是，大多数目前仍处于临床试验中的低聚化产物的分子量范围为200到250kDa。证实Enzon PEG化的Hb是不致高血压的，其携带连接到Hb的α和ε-氨基上的10个拷贝的PEG-5000链，刺激了在血液代用品领域的研究(Rolfs等人1998)。四聚体内交联Hb，低聚化的Hb和PEG化的Hb的NO结合活性(Winslow et al，1998，Vandegriff et al，1997)，显示与它们的”升压效应”没有直接相关。因此，无细胞Hb“升压活性”的降低似乎不与制品的NO结合活性，或者制品的分子大小直接相关。但是与低聚化的Hb相比，PEG化的Hb显示出显著较低水平的血管活性。Enzon的PEG-Bv-Hb，其携带10个拷贝的PEG-5000，几乎没有显示任何”升压效应”。Vandegriff等(1998)表示，相较于Hb低聚化样品，PEG-Bv-Hb显示高的粘度和胶粒渗透压。从胶粒渗透压计算的Enzon PEG化Bv-Hb的分子半径比低聚化Hb的大得多(15nm)，而且计算的分子半径与它的计算的分子量114,000道尔顿不相符(Vandegriff et.al.1998)。因此，假定Hb的大小应当增加到分子半径为大约15nm，而且同时应伴随粘度和胶粒渗透压的显著增加以产生不致高血压的Hb溶液(Winslow 1999)。在不致高血压的Enzon PEG化的Hb中，PEG-5000链通过异肽键连接到牛Hb PEG-链的α和ε氨基上。PEG的共价连接同时伴有衍生的氨基的净正电荷的丢失。在最近的研究中，已经证实用戊二醛进行rHb1.1的单功能修饰，能一定程度地降低Hb的血管活性，而rHbl.1的低聚化作用能更高程度地降低Hb的血管活性。因此，在理解通过PEG化作用中和Hb的血管活性的分子基础中，需要考虑伴随HB的PEG化的Hb表面电荷修饰的可能作用。为了揭露由于PEG化作用而产生的Hb表面电荷微扰与产生不致高血压的Hb之间的相关性，已经开发了新方法，其涉及Hb的保守性PEG化作用，即Hb的PEG修饰而不改变Hb的表面电荷(Acharya等人1996)。在氧条件下，PEG-马来酰亚胺对Hb的Cys-93(β)的高反应性和选择性，已经用于制备每个四聚体携带两个拷贝PEG链的均一性PEG化Hb。已经生产了三种不同的PEG-HbA制品，分别携带两个拷贝的PEG-5K，或PEG-10K或PEG-20K。Hb的分子体积(流体动力学体积)，分子半径，粘度和胶粒渗透压的改变，与共价连接到Hb上的PEG的质量相关；而且所有的这些分子特性都与升压效应相关。尽管(PEG20K)2-Hb的粘度和胶粒渗透压与Enzon PEG-Bv-Hb(一种不致高血压的Hb分子)相当，这种PEG化的Hb是血管活性的。因此，血管活性问题的解决不可能通过简单地赋予分子增加的粘度，胶粒渗透压和分子体积(流体动力学体积)来完成。专利技术概述本专利技术提供了一种修饰的Hb，其具有增加的分子体积，高粘度，高胶粒渗透压，高O2亲和力，其是不致高血压的并且还能解决血管活性问题。此外，本专利技术修饰的Hb可以在简单、灵活而且高效的方法中生产，其使本专利技术修饰的Hb的制备有成本效益。更特别地，本专利技术提供了一种具有6±1个PEG链的血红蛋白分子(Hb)，其中所述PEG链中的两个结合到Hb的Cys-93(β)上，而余下的PEG链结合到在Hb的ε-氨基上引入的巯基上。本专利技术还提供了制备修饰的血红蛋白分子(Hb)的方法，包括以下步骤(a)使Hb与8-15倍过量的亚氨基四氢噻吩反应以形成巯基化的Hb；和(b)使巯基化的Hb与16-30倍过量的用马来酰亚胺部分官能化的PEG反应，来形成修饰的Hb。最后，本专利技术提供了根据前述方法制备的修饰的Hb分子。附图简述附图说明图1提供了亚氨基四氢噻吩依赖的巯基化作用介导的基于马来酰亚胺化学的Hb PEG化的示意图。A描述了巯基化作用，简化方式的PEG化反应的第一阶段，以及马来酰亚胺官能化的PEG链结合到巯基化蛋白上。连接的PEG链描绘为伸出中心蛋白(Hb)核心的臂。B亚氨基四氢噻吩与Hb的ε-氨基反应，产生γ-巯基丁脒基部分。图2描述了巯基化作用介导的基于PEG马来酰亚胺的Hb的PEG化。A亚氨基四氢噻吩对与马来酰亚胺(maleido)苯基PEG-5000孵育的Hb大小增加的影响。溶于PBS pH7.4中的Hb(0.5mm的四聚体)，在存在或缺乏已知浓度的亚氨基四氢噻吩时，与10mM马来酰亚胺苯基PEG-5000于4℃孵育4小时。利用串联连接的两个superose柱，使用FPLC通过大小排阻色谱法对产物进行分析。柱子用PBS以每分钟0.5ml的流速进行洗脱。标记HbA，(PEG5K)2-Hb，(PEG10K)2-Hb和(PEG20K)2-Hb的洗脱位置，作为追踪Hb分子大小增加的指导，其伴随着PEG链结合。1对照Hb。2缺乏亚氨基四氢噻吩时，与10mM马来酰亚胺苯基PEG-5000孵育4小时的HbA。3存在1mM(2倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时的PEG化。4存在2.5mM(5倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时的PEG化。5存在5mM(10倍摩尔过量)亚氨基四氢噻吩时本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：S·A·阿查里雅，B·N·曼朱拉，
申请(专利权)人：犹太大学阿尔伯特爱因斯坦医学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。