一种检测板蓝根抗炎活性的方法技术

本发明专利技术一种检测板蓝根抗炎活性的方法，属于中药活性检测技术领域。本发明专利技术所述的方法包括待测品溶液的制备和对照品的制备，根据待测品可以对ＣＯＸ－２产生抑制作用，采用应用亲和素和生物素的酶联免疫吸附实验来对待测品的抗炎活性进行检定，并对获得的检定结果按照标准曲线法进行可靠性检验及效价计算来获得待测品的抗炎活性，本发明专利技术首次建立了板蓝根的生物学抗炎测定方法，具有在检测过程中所受干扰因素少、操作简单、节约经费并可独立表征抗炎活性的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于中药活性检测
，具体涉及板蓝根抗炎活性检测方法

技术介绍
炎症是宿主细胞对病原体或伤害的 一种保护性应答反应，会引起发热、红肿以及花生四烯酸调控功能的紊乱。目前研究抗炎活性的药理实验方法主要有整体动物法，多数通过一些炎症介质致炎，然后测定炎症部位的增重、体积变化等，如小鼠耳肿胀、大鼠足肿胀实验法。整体动物实验所受干扰因素多，操作繁复，经费消耗大。因此不适合作为板蓝根生物效价检测的方法。而离体实验均为基于抗炎作用机制的方法，且大多只能代表某一 因子的变化，无法独立表征抗炎作用。cox是动物体内前列腺素生成的限速酶，具有许多十分重要的生理功能。该酶催化花生四烯酸生成类花生酸，包括前列腺素(PGs),凝血烷A2 (TXA2)和白细胞三烯(LTs ),从而引起炎症反应。研究表明，至少存在两种COX异构体， 一种是组成型的，称为C0X-1; —种是诱导型的，称为C0X-2。 C0X-1启动一些特定的前列腺素的合成，人体内这些前列腺素可以保护胃肠粘膜内层，限制胃酸分泌；调节肾的血液动力学和水盐平衡；还可以保持血管内皮的抗血栓状态。另一种催化产物凝血烷A2 (TXA2)可以刺激血小板凝聚，从而保持正常的止血功能。C0X-2在炎症因子的诱导下可大量表达，如IL-1、 TNF、 LPS、有丝分裂原(佛波酯)、cAMP和血清等都可诱导C0X-2表达，表达水平可升高10-80倍。而COX-1对此刺激表达无变化。提示COX-2参与了炎症过程，炎症细胞中PGs升高是C0X-2在炎症介质的刺激下向上调节的结果。目前对于非甾体类抗炎药的研究多考察其对C0X-2活性的影响，以表征药物的抗炎活性。
技术实现思路
鉴于C0X-2活性的受待测品影响程度在很大程度上可以表征待测品对于炎症反应的原理，本专利技术提供了 ，；险测原理如用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包^L单抗的孩i孔中依次加入COX-2抗原、生物素化的抗人C0X-2抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的C0X-2呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(0D值)，计算样品浓度。本专利技术采用的技术方案如下，它包括以下步骤(1)、取待测样品，力口 6-20倍强极性溶剂进行静置提取0.5-2小时，滤过取滤液，挥干溶剂，残渣用緩冲液溶解，离心取上清液，加Tris-HCl緩冲液配制所需浓度，滤过，收集滤液得待测品；(2)、按试剂盒说明书配制不同浓度的C0X-2酶标准品溶液；(3 )、配制lmg/ml的阿司匹才木对照品液;(4)、取出酶标板，按步骤(2)中次序对应分别加入50)a1的对照品和40 - 60jal步骤(1)所得的待测品，在待测品孔中加入5 - 20 n 1生物素标记液，在对照品和;f寺测品中加入80 -120ju 1酶标i己:;容液，32 - 40。C下避光反应40 - 80min后，用洗板机清洗，然后每孔加入底物A、 B液各20 - 700ju 1, 32 - 40°C下避光反应5 - 10min后，每孑L力口入20 - 80 |a 1终止液，终止反应；(5 )、将步骤(3 )获得的反应液在波长400 - 600歷的酶标仪上读取OD值，根据标准曲线法计算待测品抑制COX-2的抑制率和待测品的抗炎活性。上述的检测板蓝根抗炎活性的方法，其中所述的强极性溶剂为选自甲醇、乙醇、丙酮中的一种或两种以上的混合物。标准曲线法的计算方法如下:孔数标准品浓度lg值OD值1Xiyi2yi3X)yinXn61 )标准曲线的计算分别计算标准曲线的直线回归系数(即斜率)b和截距a,从而得到相应标准曲线的直线回归方程。回归系数b=》)2 二 i: ;2>i^巨a=7 -bx直线回归方程,2)回归系数的显著性检验判断回归得到的方程是否成立,即x、 y是否存在着回归关系，可采用t检验。假设H。 b=0，在假设H。成立的条件下，计算t值。估计标准误回归系数标准误<formula>formula see original document page 7</formula>式中，yi为标准品的实际吸光度；？为由标准曲线的直线回归方程计算得到的估计吸光度；？为标准品实际吸光度的均值；Xi为标准品实际浓度lg值；5为标准品实际浓度lg值的均值。对于相应自由度(2n-4 )给定的显著性水平cc (通常a=0.05)，查表得tc若ltl〉t^)，则拒绝H。，认为回归效果显著，即x、 y具有直线回归关系；若卜|《/2( -2),则接受H。，认为回归效果不显著，即x、 y不具有直线回归关系。3) 供试品浓度(或数学转换值)的计算当回归系数具有显著意义时，方可进行供试品浓度(或数学转换值)的计算。测得标准品吸光度的均值后，根据标准曲线的直线回归方程计算供试品的浓度lg值。供试品浓度的lg值x。=^ib供试品浓度C=lg-'x。4) 供试品浓度或lg值的可信限及可信限率的计算可信限的计算计算供试品浓度在95%置信水平(a=0. 05)的可信限。式中，n为标准品的平^f于测定^:; m为供试品的平4于测定it; X。为根据线性方程计算得到的供试品浓度的lg值；Y。为供试品吸光度的均值。可信限率FL%= C.厂C低x 100%2C5 )供试品效价的计算将计算得到的供试品浓度(将lg值转换为浓度)再乘于供试品稀释度，即得供试品的效价。本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果1、本专利技术克服了目前抗炎活性实验中整体动物实验方法所受干扰因素多，操作繁复的缺点，具有易于才喿作且结果稳定的优点。2、 本专利技术克服了以往离体实验不能独立表征抗炎活性的缺点，通过C0X-2酶联免疫测定来对待测品抗炎活性进行生物学测定来完成独立表征板蓝根的抗炎活性。3、 本专利技术开创了 一种新的检测中药材样品抗炎活性的方法，通过生物学手段来达到对样品中某一活性成分进行定量和定性的#全测。附图说明1、 图1为C0X-2酶标准曲线；2、 图2为阿司匹林COX-2抑制率标准曲线。具体实施例方式为使本专利技术的内容更易被了解，下面以板蓝根为例对本专利技术专利申请作进一步说明，本专利技术所使用的药材与试剂如下板蓝根药材，为来源于十字花科(Cruciferae)植物菘蓝/w〃51 // (37g(7〃c5 Fort. 的干丈喿才艮；阿司匹林对照品，中国药品生物制品检定所；pH7. 8的Tris-HCl緩冲液；酶标仪(波长范围400nm - 760nm);C0X-2酶和C0X-2活性检测试剂盒，美国Cayman公司。具体实施步骤1.供试品溶液的制备取板蓝根样品，置于具塞锥形瓶中，加12倍板蓝根样品量9的丙酮在静置条件下提取1小时，滤过，取滤液，回收溶剂，挥干溶剂后的残渣用Tris-HC1缓冲液(pH7. 8)溶解并离心，取上 清液，加Tris-HC1緩冲液配制所需的浓度，滤过，收集滤液， 即得供试品溶液。2. C0X-2酶标准品溶液的制备取C0X-2标准品1瓶(100ng ),临用前以Tris-藍緩沖液 (pH7. 8 )溶解并稀释至lml,盖好后静置10分钟以上，然后反 复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测板蓝根抗炎活性的方法，它包括以下步骤：　（１）、取待测样品，加６－２０倍待测品样品量的强极性溶剂进行静置提取０．５－２小时，滤过，取滤液，挥干溶剂，残渣用缓冲液溶解，离心取上清液，加Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液配制所需浓度，滤过，收 集滤液得待测品；　（２）、按试剂盒说明书配制不同浓度的ＣＯＸ－２酶标准品溶液；　（３）、配制１ｍｇ／ｍｌ的阿司匹林对照品液；　（４）、取出酶标板，在空白孔中分别加入５０μｌ步骤（２）所得的对照品和４０－６０μｌ步骤（１）所 得的待测品，在待测品孔中加入５－２０μｌ生物素标记液，在对照品和待测品中加入８０－１２０μｌ酶标记溶液，３２－４０℃下避光反应４０－８０ｍｉｎ后，用洗板机清洗，然后每孔加入底物Ａ、Ｂ液各２０－７００μｌ，３２－４０℃下避光反应５－１０ｍｉｎ后，每孔加入２０－８０μｌ终止液，终止反应；　（５）、将步骤（４）获得的反应液在波长４００－６００ｎｍ的酶标仪上读取ＯＤ值，根据标准曲线法计算待测品抑制ＣＯＸ－２的抑制率和待测品的抗炎活性。

【技术特征摘要】
1、一种检测板蓝根抗炎活性的方法，它包括以下步骤(1)、取待测样品，加6-20倍待测品样品量的强极性溶剂进行静置提取0.5-2小时，滤过，取滤液，挥干溶剂，残渣用缓冲液溶解，离心取上清液，加Tris-HCl缓冲液配制所需浓度，滤过，收集滤液得待测品；(2)、按试剂盒说明书配制不同浓度的COX-2酶标准品溶液；(3)、配制1mg/ml的阿司匹林对照品液；(4)、取出酶标板，在空白孔中分别加入50μl步骤(2)所得的对照品和40-60μl步骤(1)所得的待测品，在待测品孔中加入5-20μl生物素标记液，在对照品和待测品中加入80-120μl酶标记溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖小河，鄢丹，罗云，李寒冰，魏丽，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三○二医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]