本发明专利技术公开了一种检测双烯雌酚的直接竞争法酶联免疫检测试剂盒。本发明专利技术所提供的双烯雌酚的酶联免疫试剂盒包括双烯雌酚特异性抗体、包被有双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚标准品和双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物及工作液。本发明专利技术的检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的双烯雌酚。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶联免疫和兽药残留检测
，具体而言，本专利技术涉及一种用于检测 双烯雌酚的直接竞争法酶联免疫检测试剂盒。
技术介绍
双烯雌酚(dienestrol， DE)是一种人工合成的非甾体类雌激素，其化学名为3,4-双(对 羟基苯基)-2,4-己二烯，含有酚羟基，是一种弱酸性化合物。主要应用于提高奶牛产奶量和畜 禽动物的生长催肥。相对于天然雌激素，人工合成雌激素通常稳定，在体内滞留时间长,因为 其是亲脂性物质,易在人和动物的脂肪及组织中残留。雌激素可以通过食物链危害人类健 康，使女性幼儿提前发育，男性儿童乳腺发育成女性化；使男性生殖发育异常与病变及女 性乳腺癌和子宫内膜异位症发生率上升，同时具有致癌作用。已被世界上许多国家禁止应 用。现有的双烯雌酚检测方法为色谱法(参见，例如，中国食品卫生杂志，2006， 18 (5)， 第420-422页)，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技术人员及复杂的仪器设备， 且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术 为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立的直接竞争法酶联免疫 检测技术较间接方法进一步縮短了检测时间。该技术的关键是人工抗原和酶标记抗原的合 成及抗体的制备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒。 本专利技术试剂盒的检测原理为将双烯雌酚抗体包被于固相载体上，加入样本或双烯雌酚标准品溶液并加入酶标记双 烯雌酚辣根过氧化物酶标记物工作液，待测样品中的双烯雌酚与酶标记双烯雌酚竞争固相 化的双烯雌酚抗体，通过洗涤除去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值， 该值与样品中双烯雌酚的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出双烯雌酚浓度范围。本专利技术提供了一种快速检测双烯雌酚的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括双烯雌酚特 异性抗体、包被有双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物及其工 作液。其中双烯雌酚特异性抗体为兔抗双烯雌酚的多克隆抗体，用双烯雌酚与载体蛋白偶 联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物采 用化学方法偶联得到，标记所用的酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为琥珀酸酐法。用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。 载体的形式是微量反应板凹孔。为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括双烯雌酚标准溶液、 显色剂A液和显色剂B液、浓縮洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。所述的洗涤液为含有0.05%—0.5%吐温一20的0.01mol/LpH 7.4的磷酸盐缓冲液。显 色剂A液含有底物过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液含有供氢体四甲基联苯胺或邻苯二胺， 应用时两种混合液按l比例混合。所述的浓縮样品稀释液为含0.1%吐温一20的0. 1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液。所述的双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物工作液为直接可以应用的 液体，达到最佳应用浓度，不需再稀释。另一方面，本专利技术还提供了一种检测食品、畜产品、水产品或饲料样品中双烯雌酚含 量的方法，包括步骤(1) 样品前处理；(2) 用本专利技术所述试剂盒对经过前处理的样品进行检测，向包被有双烯雌酚抗体的酶标 板孔中加入标准品或样品溶液100ul，再加入双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物工作液50ul， 室温温育30分钟，洗液洗板4次，加等体积的显色剂A液和B液各50ul，室温温育15分 钟、50ul终止液终止反应，酶标仪450nm波长测定吸光度值；(3) 分析检测结果。本专利技术所述样品前处理是本领域通常所述的检测前对样品进行的常规处理，通常包括 样品的粉碎、匀浆、有机溶剂(例如，甲醇、乙酸乙酯等)提取。 有益效果本专利技术检测双烯雌酚的试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫测定法定性或定量检测样品 中双烯雌酚含量；进一步縮短了检测时间，为l个小时以内，对样品的前处理要求低，样 品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。本专利技术采用高特异性的双烯雌酚多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少 试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本专利技术具有灵 敏度高、特异性强、精确度高、准确度高、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化 程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料、动物源性产品及食品检测中发挥重要 作用。附图说明图l为双烯雌酚抑制曲线，其中横坐标为抑制浓度，抑制浓度由左至右分别为0， 1， 3， 9， 27， 81 (ng/ml)，纵坐标为吸光度(OD)。提供下述实施例是为了更好地进一步理解本专利技术，而决不对本专利技术的内容和保护范围 构成任何限制。实施例实施例1双烯雌酚免疫原的合成及免疫血清的制备1.1试剂与仪器双烯雌酚(德国Dr)，琥珀酸酐(Sigma公司)，吡啶(Sigma公司)，EDC (上海共价 化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、匙钥孔血蓝蛋白(KLH， Sigma公司)，辣根过 氧化物酶(HRP)(上海楷洋生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909,北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057 型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析 柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm最大离心力12100rcf， 2mlxl2)。 1.2双烯雌酚人工抗原的合成I. 2.1免疫原的合成称取26.6毫克(O.lmmol)双烯雌酚溶于lmlDMSO中,充分搅拌使其完全溶解，加入II. 7毫克氯乙酸钠,室温搅拌1小时；称取50毫克KLH，以0.1mol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其占总 溶液的50%，将氯乙酸钠活化的双烯雌酚加入到KLH溶液中，以10M氢氧化钠调溶液pH 值至ll，加入EDC0.2-0.3M (约100mg)，搅拌反应过夜。过SephdexG-25M凝胶柱提纯，5即得本专利技术所述的双烯雌酚-KLH偶联物(DE-KLH)，作为下述实验的免疫原。I. 2.2包被抗原的合成称取26.6毫克(O.lmmol)双烯雌酚溶于lmlDMSO中，充分搅拌使其完全溶解，加入II. 7毫克6-溴己酸，室温搅拌1小时；称取67毫克BSA，以0.1 mol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO充分搅拌，使其占总 溶液的50%，将6-溴己酸活化的双烯雌酚加入到BSA溶液中，以10M氢氧化钠调溶液pH 值至ll，加入EDC0.2-0.3M (约100mg)，搅拌反应过夜。过S印hdexG-25M凝胶柱提纯， 即得本专利技术所述的双烯雌酚-BSA偶联物(DE-BSA),作为下述实验的包被抗原。 1.2.3酶标记抗原的合成称取26.6毫克(O.lmmoI)的双烯雌酚溶于lml无水吡啶中，加入10毫克琥珀酸酐， 室温下搅拌4小时，N2吹干，以一定体积DMSO复溶。称取44毫克辣根过氧化物酶(HRP)，以0.1 mol/L的PBS溶解，缓慢滴加DMSO 充分搅拌，使其占总溶液的50%，将琥珀酸酐活化的双烯雌酚加入到HRP溶液中，以10M 氢氧化钠调溶液pH值至11，加入EDC 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测双烯雌酚的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括：双烯雌酚特异性抗体、包被有双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚标准品和双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物及工作液。
【技术特征摘要】
1.一种检测双烯雌酚的直接竞争法酶联免疫试剂盒，其中包括双烯雌酚特异性抗体、包被 有双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚标准品和双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物及工作液。2. 根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括包被有双烯雌酚特异性抗体的酶标板、双烯雌酚辣根过氧化物酶标记物工作液、双烯雌酚标准品溶液、显色剂A液和显色剂B液、洗涤液、终止液、浓縮样品稀释液。3. 根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述双烯雌酚特异性抗体为多克隆抗体。4. 根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的酶标记双烯雌酚所用的酶为辣根过氧化物酶。5. 根据权利要求4所述的辣根过氧化物酶标记双烯雌酚，所述标记方法为琥珀酸酐法。6. 根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的洗涤液为含有0. 05...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨曙明，于洪侠，陈刚，邱静，李平，张薇薇，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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