一种双烯雌酚的检测试剂盒及其检测方法技术

一种检测双烯雌酚的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析（ＴＲＦＩＡ）技术领域，用于食品和饲料中双烯雌酚（ＤＥＮ）含量的检测。本发明专利技术配制的试剂盒，采用ＴＲＦＩＡ检测ＤＥＮ，测定的基础是标记免疫反应。微孔板包被有ＤＥＮ－载体蛋白，加入ＤＥＮ标准溶液或样品处里液，再加入ＤＥＮ抗体。游离的ＤＥＮ与微孔板上的ＤＥＮ－载体蛋白竞争ＤＥＮ抗体，没有连接的ＤＥＮ抗体被洗涤除去，加入Ｅｕ３＋－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的Ｅｕ３＋－羊抗兔抗体被洗涤除去。加增强液后，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度ｃｐｓ，荧光强度与样品中的ＤＥＮ浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中ＤＥＮ的含量。本发明专利技术提供的检测ＤＥＮ试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到０．０１ｎｇ／ｍＬ以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测双烯雌酚(dienoestrol， DEN)的检测试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(Time resolvedfluoroisnmunoassay， TRFIA)
，用于食品和饲料中双烯雌酚药物残留量的检测。
技术介绍
双烯雌酚是一种与己烯雌酚结构类似的人工合成的具有酚羟基结构的二苯乙烯类雌性激素，有与内源性激素相似的生物效应而被广泛地应用于临床中。近年来，许多国家将其加入到动物饲料中，以提高家禽家畜的饲养效率。动物通过食物获得的雌性激素一部分被排泄到环境中，一部分在动物体内残留，并通过食物链在人体内富集。激素类药物残留会使正常人的生理功能发生紊乱，更严重的是影响儿童正常的生长发育，引发动物和人的癌症和致畸毒性，而且妊娠期间使用还能引起后代生殖系统疾病。 由于其致癌作用，我国和FDA、欧盟、美国、日本、加拿大已禁止己烯雌酚在饲料中的使用。目前国内使用较多的为己烯雌酚，国家规定动物组织中不得检出己烯雌酚，双烯雌酚已证实为己烯雌酚的代谢产物。因此，快速准确检测雌性激素对于估计食品安全的潜在因素是很必须的。 双烯雌酚的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱/质谱法(GC/MS)和酶联免疫检测方法(ELISA)等。通常以ELISA作为在现场抽样快速筛选检验方法，HPLC或GC-MS作为确证性检验方法，目前，我国检测机构所用双烯雌酚ELISA检测试剂盒多为国外进口 ，其价格昂贵，很难在国内推广应用。国产双烯雌酚ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不高、假阳性率高、不稳定等问题。 时间分辨荧光免疫分析检测技术是近来发展迅速的高灵敏检测手段。TRFIA其原理是利用具有双功能基团结构的螯合剂，其一端和镧系元素结合，另一端和抗体(抗原)上的自由氨基连接，制成Eu标记抗体(抗原)，它与待测样品中的抗原(抗体)结合成免疫复合物。理想情况下，测定复合物中镧系元素的荧光强度就能确定样品中抗原的含量，但实际上这种复合物的荧光强度相当弱，只有再加入一种增强溶液(Enhancement solution)，使镧系元素从复合物中解离下来，并与增强液中所含的P-奈甲酰三氟丙酮(P-NTA)重新形成微胶囊，在紫外光的激发下发射很强的荧光，增强效果上百万倍。用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，即可确定样品中抗原的量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种双烯雌酚试剂盒及检测方法，用于定性或定量地检测食品和饲料中双烯雌酚的残留量；检测时间短、平均回收率高、批内、批间误差小，并具有简便、快速、准确的特点。 本专利技术的技术方案该检测双烯雌酚的试剂盒是由1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液所组3成。 本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)来检测DEN。采用TRFIA的技术主要有两个方面第一，特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二， Eu标记抗体的制备。 测定方法为测定的基础是标记免疫反应。包被有DEN-载体蛋白的微孔板，加入DEN标准溶液或已处理好的样品处理液到各自的微孔中、再加入DEN抗体，振荡反应，游离的DEN与微孔板上的DEN-载体蛋白竞争DEN抗体，洗涤液洗涤，没有连接的DEN抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的￡1!3+-羊抗兔抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中DEN的量。 本专利技术的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0. Olng/mL以上。附图说明 图1 :检测双烯雌酚的试剂盒示意图。1、多孔包被板，2、缓冲液，3、双烯雌酚标准溶液，4、双烯雌酚的抗体，5、铕标记的羊抗兔抗体，6、洗涤液，7、增强液。 图2 :DEN-TRFIA标准曲线图。具体实施例方式实施例1 :制备试剂盒和检测动物组织样品 免疫抗原的制备 本专利技术所述的人工免疫抗原为改造双烯雌酚(DEN)成为双烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)，再采用混合酸酐法与大分子载体蛋白结合，以合成的DEN-HS-BSA作为免疫抗原进行动物免疫。 称取20mg lOOmg双烯雌酚(DEN)，加入5mL吡啶后，加入10mg 50mg琥珀酸，室温，搅拌过夜，反应完成，用酸水洗涤，抽滤沉淀，干燥，得双烯雌酚半琥珀酸酯(DEN-HS)。 载体蛋白采用牛血清白蛋白(BSA)。称取30mg 300mg牛血清白蛋白，溶解于50%二氧六环水溶液6mL 10mL中，调pH值为9 10，为A液；称取10mg 50mg DEN-HS，溶于2mL 二氧六环中，置4°C 10min，依次加入三正丁胺20 y L和氯甲酸异丁酯10 y L，于4°C搅拌30min，作为B液。将A液在fC滴入B液，搅拌过夜。将反应液对蒸馏水透析72小时，期间换蒸馏水5次。或萄聚糖凝胶G50 (S印hadexG50)柱提纯，以0. 05mol/L pH8. 0碳酸盐缓冲溶液洗脱。收集透析纯化液或第1峰的柱洗脱液，分装保存于-2(TC作免疫原用。 双烯雌酚多克隆抗体的制备 将上述合成的双烯雌酚-牛血清白蛋白结合物(DEN-BSA)作免疫抗原，采用皮内或皮下多点注射方式，接种1kg 1. 5kg雄性新西兰兔；每隔4周免疫1次，第一次免疫时，在免疫原中加等量弗氏完全佐剂混匀制成乳剂，以后免疫均加等量弗氏不完全佐剂；自第二次免疫开始，每次免疫后8 10天采血测试抗血清效价。观察抗血清效价增长情况，达到满意效价时将取全血，分离血清。 抗血清经过3次硫酸铵沉淀后，再用层析柱分离纯化，对磷酸盐缓冲溶液透析。吸取抗血清10mL，平衡至室温，加入等量的0. 01mol/LpH7. 8磷酸盐缓冲溶液，充分混匀，加入20mL饱和硫酸铵溶液(以浓氨水调至pH7. 8)，摇匀，4静止1小时后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。沉淀物用20mL O.Olmol/L pH7. 8磷酸盐缓冲溶液溶解，然后加入10mL饱和硫酸铵溶液(pH7. 8)，摇匀，4静止30分钟后，以5000转/分钟离心5分钟，去上清液。重复盐析两次。最终以2mL0.01mol/L pH7. 8磷酸盐缓冲溶液溶解免疫球蛋白IgG沉淀物，装入透析袋，对2000mL 0. 01mol/L pH7. 2磷酸盐缓冲溶液透析12小时。将上述透析液，加入到约25克湿重的纤维素DEAE-52 (取纤维素DEAE-52干粉10克，用500mL0. 01mol/L pH8. 0的磷酸盐缓冲溶液浸泡过夜，4t:平衡1小时，每10分钟搅拌一次，倾入布氏漏斗中，用pH8. 0的0. 2mol/L磷酸盐缓冲溶液洗滤。收集滤液，再对O. 01mol/LpH7. 4磷酸盐缓冲溶液透析12小时，最后加入适量甘油_201:保存。 Eu3+_羊抗兔抗体的制备 取溶解于50mmol/L PBS pH7. 0的5g/L羊抗兔抗体lmL 2mL，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0. 15mol/L NaCl的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测双烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板（１），缓冲液（２），双烯雌酚标准溶液（３），双烯雌酚的抗体（４），铕标记的羊抗兔抗体（５），洗涤液（６）和增强液（７）所组成。

【技术特征摘要】
一种检测双烯雌酚的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由多孔包被板(1)，缓冲液(2)，双烯雌酚标准溶液(3)，双烯雌酚的抗体(4)，铕标记的羊抗兔抗体(5)，洗涤液(6)和增强液(7)所组成。2. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/L pH9. 6Na2C03-NaHC03的缓冲液将DEN-OVA稀释至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各 孔加100 ii L， 4t:放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150 ii L含3g/L OVA的上述缓冲液封 闭，4t:放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-201:冷冻保存。3. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中的双烯雌酚标准溶液(3)，从DEN纯品中稀释得 到，稀释液为0. lmol/L pH7. 5磷酸盐缓冲液，共6瓶，DEN浓度分别为:0ng/mL，0. lng/mL， lng/mL，10ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL。4. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中的双烯雌酚的抗体冻干品(4)，用弗氏完全佐剂 或弗氏不完全佐剂1. 2mL混合2mgDEN-BSA，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂， 取600 ii L制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔和BALB/c小白鼠身上多位点地进 行皮下注射，在免疫3 4次后，可进行鉴定，血清和腹水合格后稀释、分装、冻干备用。5. 根据权利要求l所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(5)，将购得的羊抗 兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9. 0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入 Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]_ 二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰， 稀释、分装备用。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：宓晓黎，黄丽俊，陆茂林，肖华龙，李利东，杜妹莲，
申请(专利权)人：江苏省微生物研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]